1、骨髓間充質干細胞對失血性休克大鼠早期炎性反應的影響作者：李彤 王子薇 王淑梅 張學軍 李艷秋單位：吉林大學口腔醫院通訊作者：王淑梅 單位：吉林大學第二醫院麻醉科基金項目：吉林省產業技術研究與開發項目 吉發改高技【2013】779號【摘要】 目的 探討骨髓間充質干細胞對失血性休克大鼠血清炎性因子及重要臟器的影響。方法 體外分離培養大鼠骨髓間充質干細胞。雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、治療組（n=20）。改良Wiggers法制備大鼠出血性休克模型，休克持續90 min。治療組在復蘇前給予106個第3代骨髓間充質干細胞PBS懸液1ml，假手術組和模型組給予相同體積PBS溶液。分別于復蘇后6h、

2、12h、24h、48h、72h取血清，ELISA檢測TNF-，IL-1、IL-6、IL-10水平，HE染色觀察心、肝、肺、腎病理損傷。結果 治療組血清TNF-和IL-6在復蘇后12h-72h內較模型組顯著下降（p0.05）；治療組血清IL-1在復蘇后6h-12h內較模型組下降顯著（p0.05）；治療組IL-10水平在復蘇后6h-48h內均較模型組有顯著升高（p0.05）。骨髓間充質干細胞減輕肺、肝、腎、心等器官的炎性細胞浸潤。結論 骨髓間充質干細胞能調節失血性休克早期重要炎性因子水平，促進機體促炎-抗炎系統平衡。【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；失血性休克；炎癥因子；免疫調節The effects

3、 of BMSCs on early inflammatory response in hemorrhagic shock rats Xie Chong, He Jian-bin, Yu Qian, Xing Bai-chun, Yu Dai-hua, Yao Li-nong. Department of Anesthesiology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710038, China【Abstract】 Objective The purpose of this study was to i

4、nvestigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on serum levels of early inflammatory cytokines and major organ damage after hemorrhagic shock in rat. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and treatment group (n = 20). 106 BMSCs of the

5、 third passage were infused in treatment group before resuscitation. The other 2 groups were given PBS. Serum levels of TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 were detected by ELISA at 6h, 12h, 24h, 48h, 72h after resuscitation. Heart, liver, lung, kidney were observed by HE staining. Results compared with model g

6、roup, serum levels of TNF- and IL-6 in treatment group significantly reduced between 12h-72h after resuscitation (P0.05); serum levels of IL-1 decreased significantly between 6h-12h. (P0.05), the level of IL-10 in treatment group increased within 6h-48h after resuscitation compared with that of mode

7、l group (P0.05). BMSCs decreased the inflammation induced by hemorrhagic shock in lung, liver, kidney and heart. Conclusions BMSCs can play an important role on inmune regulation at early inflammatory response after resuscitation of hemorrhagic shock and promotes the balance of pro-inflammation and

8、anti-inflammation in rat. Key words：Bone mesenchymal stem cells；Hemorrhagic shock；Inflammatory factors；Immunoregulation失血性休克由于組織有效灌流不足、細胞代謝紊亂以及菌群移位產生大量炎性因子，導致機體抗炎-促炎自穩態失衡，促炎因子大量釋放，最終可演變為全身炎性反應綜合癥（SIRS），成為全身多器官功能不全綜合癥（MODF）的發病基礎，后者是導致機體死亡的最主要原因1。骨髓間充質干細胞具有極低的免疫原性和獨特的免疫調節功能2，在多種組織損傷和修復中表現出良好的免疫調節能力，但對

9、失血性休克后免疫失衡的影響尚未研究。本研究利用培養的大鼠骨髓間充質干細胞在大鼠失血性休克模型，調查間充質干細胞對炎性細胞因子的表達的影響，以證實其減輕失血性休克后炎性反應的效果，從而探討失血性休克臨床救治的新思路。材料與方法實驗動物 SPF級SD大鼠，質量250300g。購于第四軍醫大學實驗動物中心。本實驗經第四軍醫大學附屬唐都醫院實驗動物管理委員會批準。主要試劑 DMEM-LG培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PE anti-rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106（美國Biolegent公司）；戊巴比妥鈉（第四軍醫大學生物技術中心）；大鼠TNF-

10、 ELISA試劑盒、IL-1 ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒（美國RDD公司）；鏈霉素、氨芐青霉素（華北制藥有限公司）。主要儀器 CO2恒溫孵育箱（美國Thermo公司）；液閃計數儀 （美國Beckman公司）；IMT-2型倒置生物學顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-4型恒溫水浴箱(金壇富華電器有限公司)；流式細胞儀 （美國BD FACSAriaTM）；高速調溫離心機（美國Sigma公司）大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養、擴增和鑒定 大鼠頸椎脫臼處死，取雙后肢脛骨和股骨。無菌2ml注射器吸取培養基迅速反復沖洗骨髓腔多次，直至沖出大部分骨髓。加入

11、含10%胎牛血清的DMEM-LG培養基，無菌玻璃管反復吹打，直至細胞充分重懸于培養基。調整細胞濃度至1106/cm2,接種細胞于75 cm2的塑料培養瓶中，37,5% CO2孵箱培養、傳代。取第3代骨髓間充質干細胞棄去培養基，PBS溶液沖洗后棄去，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞皺縮變圓并部分脫落時加入胎牛血清終止消化，反復吹打貼壁細胞至絕大部分脫落，制成細胞懸液。離心取上清，PBS溶液調整細胞濃度至1107/ml。加入PE 抗鼠 CD29、PE 抗鼠CD34、PE 抗鼠CD45、PE 抗鼠CD90、PE 抗鼠 CD106。避光，4C冰箱內孵育30min。將制備好的樣品行流式細胞儀鑒定，Cell

12、quest軟件分析數據。大鼠失血性休克模型 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定。分離左股動脈插管，按3mg/kg體重輸注肝素鈉溶液，連接心電監護儀持續監測平均動脈壓MAP。分離右股動脈，插管連接無菌注射器。急性快速放血至MAP降至40mmHg，而后間斷放血或回輸失血維持MAP在30-40mmHg水平90min。90min后回輸全部失血進行復蘇。實驗分組 假手術組（A組）：大鼠麻醉后固定，分離左右股動脈插管，不失血，不輸注任何溶液，90min后拔管結扎血管后縫合切口。（2）失血性休克模型組（B組）：大鼠麻醉固定，分離左右股動脈插管，均造失血性休克模型，90min后回輸全部失血（5-6min回輸1ml失

13、血），之后輸注PBS溶液1ml，結扎血管，縫合切口。（3）骨髓間充質干細胞治療組（C組）：失血 90min后回輸全部失血（5-6min回輸1ml失血），之后輸注含有106個骨髓間充質干細胞的PBS溶液1ml，結扎血管，縫合切口。各組于復蘇后6h、12h、24h、48h、72h 4只大鼠取樣本待檢。血清TNF-、IL-1、IL-6、IL-10的ELISA測定 分別于復蘇后各時間點取大鼠下腔靜脈血，離心取上清，-80C冷凍保存備檢。檢測按照ELISA說明書步驟進行。各組大鼠重要臟器的HE染色 各組大鼠處死后，取下心、肝、肺、腎臟，PBS沖洗后4%甲醛固定。24h以上。高濃度酒精脫水，浸蠟包埋。蠟塊

14、切片5-8m。二甲苯脫蠟，酒精伊紅染色液染色2-3min。純酒精脫水后二甲苯透明。加拿大樹膠封固、觀察。統計分析 應用SPSS 13.0 統計軟件，數據用均數標準差(xs)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對t檢驗。結 果大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養、傳代 將骨髓內細胞離心重懸后接種于75cm2塑料培養瓶后，倒置顯微鏡下可見大量細胞懸浮于培養基中。12h即見部分細胞貼壁，呈大小不等圓形，并開始繁殖。48h-72h后可見不規則形、三角形，并伴有小突起。8-10天后，細胞大多呈梭形，突起明顯，排列呈旋渦狀。當傳代至第3代時，紡錘形和梭形細胞增多明顯，呈典型的成纖維樣細胞結構，生長

15、均勻，形態趨向一致。流式細胞儀將第3代骨髓間充質干細胞進行表面標記物檢測，骨髓間充質干細胞表明高表達CD29、CD90、CD106、CD44，低表達CD34、CD45，表達率分別98.4%、99.6%、50.2%、17.2%、1.5%、4.7%（圖1）各組大鼠血清炎性因子濃度變化 休克復蘇后相對于假手術組，模型組的TNF-、IL-1、IL-6濃度顯著上升（P0.05），而治療組TNF-、IL-1、IL-6濃度在各時間點均比模型組明顯下降（P0.05）。模型組IL-10的濃度較假手術組顯著下降（P0.05）；6h-48h內，治療組IL-10的濃度均比模型組升高（P0.05）（圖2）。臟器染色觀察

16、 模型組肺組織正常結構遭到破壞，肺間質水腫，肺泡壁明顯增寬，肺泡腔含氣量減少，大量炎癥細胞浸潤。輸注骨髓間充質干細胞則炎細胞浸潤減少，肺組織結構相對完整。休克后大鼠肝臟結構排列紊亂，肝細胞有空泡樣變性，胞質呈疏松樣改變，匯管區可見大量炎性細胞浸潤，小葉中央靜脈擴張充血，給予骨髓間充質干細胞復蘇72h后，肝結構排列正常，炎性細胞浸潤減少。休克后腎間質有少量瘀血，腎小管上皮細胞空泡變性，腎正常結構造破壞，大量炎性細胞浸潤。骨髓間充質干細胞復蘇后72h可見病損區新的毛細血管再生，炎細胞浸潤減少。模型組心肌細胞渾濁腫脹，間質水腫，橫紋不規則，胞核完整或稍大，炎性細胞浸潤。輸注骨髓間充質干細胞72h后，

17、心肌排列整齊，炎性細胞減少，胞核完整。討 論骨髓間充質干細胞是骨髓中的一種具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干細胞，具有兩個重要的生物學特征3-5：一是在特定條件下向軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、血管內皮細胞等多種組織細胞分化的能力，對損傷組織有顯著修復作用；二是獨特的免疫調節特性和極低的免疫原性。研究表明，骨髓間充質干細胞可通過多種免疫抑制介質進行多靶位、多途徑的免疫調節、控制炎性反應。對組織缺血再灌注損傷具有良好的修復功能和調節炎性反應平衡的能力。出血性休克復蘇后免疫功能紊亂是全身炎性反應綜合征的發病基礎，表現為過度的促炎反應和明顯抑制的抗炎反應6。目前的各種治療和預防措施效果有限。本

18、實驗中復蘇時給予106個骨髓間充質干細胞，能夠顯著抑制血清中炎性因子TNF-、IL-1、IL-6的水平并增高血清抗炎因子IL-10的水平，并減輕肺、肝、腎、心等重要器官的炎性細胞浸潤，促進新生血管的再生，修復受損組織，調節機體免疫功能的平衡。研究表明，CD4+CD25+ Tregs細胞7是骨髓間充質干細胞發揮免疫調節作用的重要的效應細胞。CD4+CD25+ Tregs細胞是一群具有免疫調節能力、控制免疫病理損傷的T細胞群，主要來源于CD4+CD8-細胞，特征是8-10能表達某種或某些細胞表面分子與靶細胞表面受體相互作用，使靶細胞休止于細胞周期G0/G1期而停止增殖，從而介導免疫抑制作用。CD4

19、+CD25+ Tregs細胞特異性分子標記物Foxp3是自身免疫的關鍵性調節物質，直接控制各種細胞因子的產生，其基因表達產物Scurfin蛋白是一種轉錄的阻遏物，可結合至細胞因子基因的啟動區，減少細胞因子的產量，而缺乏Scurfin可引起迅速的淋巴細胞增生性疾病，對免疫環境的自我穩定十分重要。骨髓間充質干細胞對CD4+CD25+ Tregs細胞的調節可能是其在出血性休克復蘇后發揮免疫調節的主要途徑。骨髓間充質干細胞對出血性休克的免疫調節提供了新方法，但仍有許多問題需要解決，如骨髓間充質干細胞在體外如何鑒定、大量擴增、保存？輸注的干細胞在體內的歸巢、分化情況？是否誘導感染和腫瘤？如何調節Treg

20、s細胞的發育和功能？隨著對休克病理機制更加深入的研究、對骨髓間充質干細胞認識的不斷增多，骨髓間充質干細胞將有可能用于臨床出血性休克的救治。圖1 骨髓間充質干細胞表面標記物鑒定圖2 各組大鼠血清炎性因子濃度變化（* 與模型組比較P0.05） 參考文獻1 劉良明，胡沛紅嚴重創傷休克的液體復蘇新進展J中國危重病急救醫學，2003，15(5)：314-316.2 Pittenger MF, Martin BJ: Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95:920, 2004.3 Da,

21、Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB: Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 119:22042213, 2006.4 Rochefort，G Y;Delorme,B,et alMultipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxiaJStem Cells，2006，24：22022208.5

22、Keyser KA, Beagles KE, Kiem HP: Comparison of mesenchymal stem cells from different tissues to suppress T-cell activation. Cell Transplant 16:555562, 2007.6 Sugiyama T, Kohara H, Noda M, Nagasawa T: Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity 25:977988, 20067 Uccelli A, Pi