1、-基本原理及實例應用基本原理及實例應用2013-4-132013-4-1320122012級課程進修班細胞生物學技術級課程進修班細胞生物學技術它和熒光顯微鏡的關系？它和熒光顯微鏡的關系？它和電子顯微鏡的關系？它和電子顯微鏡的關系？觀察的信號如何而來？觀察的信號如何而來？第一部分第一部分-以激光作為激發光源，采用光源針孔與檢以激光作為激發光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統。以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統。泛指將微小泛指將微小( (分辨率分辨率0.2M)0.2M)不可見或難見物不可見或

2、難見物品之影像放大品之影像放大 , ,而能被觀察的工具。而能被觀察的工具。目鏡目鏡光源光源聚焦旋鈕聚焦旋鈕光闌和聚光器光闌和聚光器載物臺載物臺物鏡物鏡用于研究熒光或熒光標記物質的光學顯微鏡。用于研究熒光或熒光標記物質的光學顯微鏡。照相裝置照相裝置分光鏡分光鏡光源（汞燈）光源（汞燈）標記了熒光的樣品標記了熒光的樣品紫外、藍、綠紫外、藍、綠高壓汞燈高壓汞燈被熒光探針染被熒光探針染色的生物樣本色的生物樣本激發激發被標記結構的被標記結構的熒光光學圖像熒光光學圖像光學成像光學成像濾鏡分光濾鏡分光物鏡物鏡標本標本針孔（針孔（pinholepinhole）焦平面焦平面熒光顯微鏡熒光顯微鏡光源針孔檢測針孔激光

3、共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡分光鏡分光鏡光源光源檢測器檢測器標本標本物鏡物鏡熒光顯微鏡系統熒光顯微鏡系統樣品樣品激光共聚焦掃描系統激光共聚焦掃描系統斷層掃描技術，斷層掃描技術，逐點逐行掃描成像逐點逐行掃描成像CCD成像技術，成像技術，一次性成像一次性成像X X光機光機CTCT機機普通熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡特點：特點：側面有掃描器接口；側面有掃描器接口；裝有微量步進馬達；裝有微量步進馬達；裝有防振動裝置；裝有防振動裝置；裝有光路轉換裝置；裝有光路轉換裝置；配高數值孔徑的物鏡。配高數值孔徑的物鏡。特點：特點：側面有掃描器接口；側面有掃描器接口；裝有微量步進馬達；裝有微量步進馬達；裝有防

4、振動裝置；裝有防振動裝置；裝有光路轉換裝置；裝有光路轉換裝置；配高數值孔徑的物鏡。配高數值孔徑的物鏡。熒光顯微鏡光源 汞燈汞燈 鹵素燈鹵素燈 其他普通光源其他普通光源特點激發波長范圍廣激發波長范圍廣 激光共聚焦顯微鏡光源 激光激光特點光色純光色純方向性好方向性好能量可調能量可調-以激光作為激發光源，采用光源針孔與檢以激光作為激發光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統。以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統。優勢優勢高垂直分辨率，使光學切片，高垂直分辨率，使光學切片，三維重建成為可能三維重建成為

5、可能高水平分辨率高水平分辨率 人眼分辨率：人眼分辨率：0.20 mm 光學顯微鏡分辨率：光學顯微鏡分辨率：0.25 mm 共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18 mm 電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率： 0.20 nm局限局限共聚焦顯微鏡的分辨率理論極限大共聚焦顯微鏡的分辨率理論極限大約是約是0.15 mm，軸向分辨率，軸向分辨率0.5 mm。觀測厚度（觀測厚度（60X）：）：50-100 mm共聚焦顯微鏡是逐點成像，成共聚焦顯微鏡是逐點成像，成像速度較慢像速度較慢1957年，年，Marvin Minsky在他的專利中首次闡明了激光掃在他的專利中首次闡明了激光掃描共聚焦顯微鏡技術的基本

6、工作原理描共聚焦顯微鏡技術的基本工作原理1967年，年，Egger和和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產生了成功地應用共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面一個光學橫斷面1970年，年， Sheppard 和和Wilson推出第一臺單光束共聚焦激推出第一臺單光束共聚焦激光掃描顯微鏡問世光掃描顯微鏡問世1985年，多個實驗室的多篇報道顯示共聚焦顯微鏡可以消年，多個實驗室的多篇報道顯示共聚焦顯微鏡可以消除焦點模糊，得到清晰的圖像，至此除焦點模糊，得到清晰的圖像，至此LSCM技術基本成熟技術基本成熟1987年，年，BIO-RAD公司推出了第一臺商業化的共聚焦顯公司推出了第一臺商業化的共聚焦顯微鏡微鏡掃描

7、器系統熒光顯微鏡系統計算機圖像存儲與處理系統Zeiss LSM-710 Confocal System激光光源第二部分第二部分光學切片光學切片高清晰成像高清晰成像熒光定量分析熒光定量分析三維圖像重建三維圖像重建多激光多通道同時掃描多激光多通道同時掃描激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光線被抑制，減少了成像的干擾。平面的光線被抑制，減少了成像的干擾。使用光色較純的激光，所以成像分辨率可使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達普通光學顯微鏡的達普通光學顯微鏡的1.41.4倍。倍。可以清晰的表現一些細微結構。可以清晰的表現一些細微結構。鼠成纖維細胞 微管渦蟲

8、綱扁蟲肌動蛋白絲檢測人類癌細胞表皮生長因子小鼠神經元細胞 按共扼聚焦的原理，通過調節針孔的大小，可控制按共扼聚焦的原理，通過調節針孔的大小，可控制樣品掃描層面的厚度。可以逐層獲得高分辨率的光樣品掃描層面的厚度。可以逐層獲得高分辨率的光學橫斷面圖像，從而對細胞和組織進行無損傷的系學橫斷面圖像，從而對細胞和組織進行無損傷的系列光學切片。列光學切片。連續分層掃描，可獲得標本真正意義上的三維數據。連續分層掃描，可獲得標本真正意義上的三維數據。經計算機數據重組，可觀測空間結構，空間定位，經計算機數據重組，可觀測空間結構，空間定位，三維重組。三維重組。胚胎的結構單層面掃描單層面掃描 多層疊加多層疊加切片分

9、層疊加激光掃描共聚焦顯微鏡通過逐層光學切片功能，可獲激光掃描共聚焦顯微鏡通過逐層光學切片功能，可獲得標本真正意義上的三維數據，經過計算機圖像處理得標本真正意義上的三維數據，經過計算機圖像處理軟件及三維重建軟件獲得標本的三維立體結構，從而軟件及三維重建軟件獲得標本的三維立體結構，從而能靈活、直觀地進行形態學觀察，并揭示細胞結構的能靈活、直觀地進行形態學觀察，并揭示細胞結構的空間關系，測量細胞結構間的空間距離空間關系，測量細胞結構間的空間距離普通熒光顯微鏡每次只能觀測一種熒光，要觀測多普通熒光顯微鏡每次只能觀測一種熒光，要觀測多種熒光標記的樣品需要多次觀測，對樣品損傷大。種熒光標記的樣品需要多次觀

10、測，對樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時掃描，多激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時掃描，多通道同時探測。通道同時探測。牛精子綠色：SYBR 14染色，活精子紅色：PI染色，死精子綠色：MitoTracker Green 紫色：Hoechst 33342 藤黃微球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環境和細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環境和不同培養時間條件下的表達差異。不同培養時間條件下的表達差異。熒光探針的特異性標記：即熒光強度與特異性標熒光探針的特異性標記：

11、即熒光強度與特異性標記蛋白的表達量成正相關。記蛋白的表達量成正相關。隨機選擇細胞或區域，測定其熒光強度值，并進隨機選擇細胞或區域，測定其熒光強度值，并進行統計分析。行統計分析。利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面積內不利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面積內不同組間熒光標記蛋白表達的差異。同組間熒光標記蛋白表達的差異。隨機圈取細胞，可得到所圈細胞的相對熒光強度值利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面積內不同組間熒光標記蛋白表達的差異。積內不同組間熒光標記蛋白表達的差異。細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環境和不同細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環境和不同

12、培養時間條件下的水平差異。培養時間條件下的水平差異。第三部分第三部分熒光：物質吸收能量后所釋放出的冷發光現象熒光：物質吸收能量后所釋放出的冷發光現象 通常為吸收短波長的能量后發散出長波長的光通常為吸收短波長的能量后發散出長波長的光熒光光譜：熒光光譜：激發光譜激發光譜通過測量熒光物質的熒光發射強度隨激發波長變化而獲得通過測量熒光物質的熒光發射強度隨激發波長變化而獲得的光譜。的光譜。發射光譜發射光譜熒光物質的熒光發射強度隨放射波長變化而獲得的光譜。熒光物質的熒光發射強度隨放射波長變化而獲得的光譜。488nm 525nmFITC450nm 490nm自發熒光：指組織細胞不經任何熒光染色便自發熒光：指

13、組織細胞不經任何熒光染色便能夠激發熒光。能夠激發熒光。免疫熒光：熒光抗體法產生熒光。免疫熒光：熒光抗體法產生熒光。外源導入熒光蛋白：利用轉基因技術將熒光外源導入熒光蛋白：利用轉基因技術將熒光蛋白基因導入細胞里，蛋白基因導入細胞里，讓其表達融合蛋白而產讓其表達融合蛋白而產生的熒光。生的熒光。組組織織和和細細胞胞中中熒熒光光的的來來源源熒光染色：很多熒光染料與組織細胞作用，熒光染色：很多熒光染料與組織細胞作用，能夠在光的作用發出特征波長的能夠在光的作用發出特征波長的熒光，借以觀察組織細胞的形態熒光，借以觀察組織細胞的形態結構、化學組成和功能。結構、化學組成和功能。由于長波能量低由于長波能量低, ,

14、細胞忍受能力強細胞忍受能力強, , 適合活體檢測。適合活體檢測。熒光極其穩定熒光極其穩定, ,在激發光照射下在激發光照射下,GFP,GFP抗光漂白能力比熒抗光漂白能力比熒光素強，適合長時間觀察。光素強，適合長時間觀察。分子量較小分子量較小, ,易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產物的空間構象和功能。的目的基因產物的空間構象和功能。238238個氨基酸組成。個氨基酸組成。吸收峰吸收峰 479 nm 479 nm發射波長發射波長 508 nm 508 nmu19621962年，日本下村修（年，日本下村修（ShimomureShimomure）等首先從

15、）等首先從維多利亞水母中分離出了維多利亞水母中分離出了GFP GFP 。u20082008年，美國科學家錢永健、馬丁年，美國科學家錢永健、馬丁沙爾菲和沙爾菲和下村修三人因發現下村修三人因發現GFPGFP而獲得諾貝爾化學獎。而獲得諾貝爾化學獎。衍生物和突變體：衍生物和突變體：BFPBFP、CFPCFP、GFPGFP、YFPYFP熒光探針與熒光標記：采用一定的標記物，使樣品中待測物熒光探針與熒光標記：采用一定的標記物，使樣品中待測物質具有特定的熒光特征，這種標記物被稱為熒光探針。這種質具有特定的熒光特征，這種標記物被稱為熒光探針。這種給樣品賦予特征熒光的操作稱作熒光標記。給樣品賦予特征熒光的操作稱

16、作熒光標記。熒光探針的種類：熒光探針的種類：大分子探針大分子探針細胞器探針細胞器探針核酸探針核酸探針金屬離子探針金屬離子探針細胞電位和細胞內細胞電位和細胞內pHpH值探針值探針分子的特殊集團結合探針分子的特殊集團結合探針選擇的依據：選擇的依據：根據實驗目的確定需要檢定的指標；根據實驗目的確定需要檢定的指標；確定可供選擇的熒光探針的范圍；確定可供選擇的熒光探針的范圍；考察熒光探針的特性是否符合熒光樣考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；品的制備要求；考察熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系考察熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統的匹配情況。統的匹配情況。標記的熒光需要在不被其他因素的干擾下能標記的熒光

17、需要在不被其他因素的干擾下能被激光共聚焦顯微鏡系統檢測到被激光共聚焦顯微鏡系統檢測到原則：盡量減小不同熒光物質間激發原則：盡量減小不同熒光物質間激發/發射光譜的重疊。發射光譜的重疊。標記要求標記要求熒光素選擇熒光素選擇/組合組合核復染核復染單標單標 無特殊限制。無特殊限制。 FITC, Cy2最佳；盡量不選擇最佳；盡量不選擇Cy5, Cy5.5（紅外（紅外) 與自發熒光沖突時，采用與自發熒光沖突時，采用Texas Red 。PI / DAPI雙標雙標FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必須順序掃描必須順序掃描)DAPI (必須必須順序掃描順序掃描

18、)三標三標FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必須順序必須順序掃描掃描)活細胞追蹤活細胞追蹤 能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間 存在、隨細胞分裂進入子細胞存在、隨細胞分裂進入子細胞 ( ) 顯微注射；轉基因技術顯微注射；轉基因技術 （GFP；GFP-ACTIN）1. 1. 作為亞細胞定位的標記作為亞細胞定位的標記蛋白定位在哪里呢蛋白定位在哪里呢 ？2. 2.作為整體結構的標記作為整體結構的標記圖中共有多少個細胞？圖中共有多少個細胞？

19、陽性蛋白的表達效率是多少？陽性蛋白的表達效率是多少？原則：盡量減小不同熒光物質間激發原則：盡量減小不同熒光物質間激發/發射光譜的重疊。發射光譜的重疊。標記要求標記要求熒光素選擇熒光素選擇/組合組合核復染核復染單標單標 無特殊限制。無特殊限制。 FITC, Cy2最佳；盡量不選擇最佳；盡量不選擇Cy5, Cy5.5（紅外（紅外) 與自發熒光沖突時，采用與自發熒光沖突時，采用Texas Red 。PI / DAPI雙標雙標FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必須順序掃描必須順序掃描)DAPI (必須必須順序掃描順序掃描)三標三標FITC/Cy2 +

20、TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必須順序必須順序掃描掃描)活細胞追蹤活細胞追蹤 能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間 存在、隨細胞分裂進入子細胞存在、隨細胞分裂進入子細胞 ( ) 顯微注射；轉基因技術顯微注射；轉基因技術 （GFP；GFP-ACTIN）樣品前處理樣品前處理組織切片：切片的厚度組織切片：切片的厚度 4-50 mm 4-50 mm 冰凍切片：優點是易操作，熒光背景低；缺點是容易破壞組織結構，不利于形態觀察。冰凍切片：優點是易操作，熒光背景低；

21、缺點是容易破壞組織結構，不利于形態觀察。 石蠟切片：優點是樣品易保存，缺點是容易引入干擾熒光。石蠟切片：優點是樣品易保存，缺點是容易引入干擾熒光。細胞標本：細胞標本： 細胞種類和純度雜細胞的干擾會導致錯誤實驗結果。細胞種類和純度雜細胞的干擾會導致錯誤實驗結果。 細胞密度：如果進行形態觀察、三維重建、定位熒光信號，細胞密度不低于細胞密度：如果進行形態觀察、三維重建、定位熒光信號，細胞密度不低于2020； 如果是測定熒光強度，細胞約占視野面積的如果是測定熒光強度，細胞約占視野面積的8080。 承載細胞的器皿：承載細胞的器皿： petri petri皿（又稱小皿）：適用面最廣，可用于活的或固定的細胞樣品。皿（又稱小皿）：適用面最廣，可用于活的或固定的細胞樣品。 蓋玻片：適用于固定的細胞。蓋玻片：適用于固定的細胞。 樣品前處理樣品前處理-熒光標記熒光標記-上機觀察上機觀察 樣品前處理樣品前處理-熒光標記熒光標記-上機觀察上機觀察熒光標記熒光標記染料直接染色：生物樣品與熒光探針直接作用，使樣染料直接染色：生物樣品與熒光探針直接作用，使樣品具有熒光。品具有熒光。免疫熒光：是將抗體標記上熒光素與細胞或組織內相免疫熒光：是將抗體標記上熒光素與細胞或組織內相應的抗原結合后，通過觀