1、去細胞牛松質骨復合骨髓基質干細胞修復兔橈骨缺損    【摘要】  目的：研制理想的能夠修復骨缺損的骨材料，為其在骨缺損修復領域中的臨床應用提供實驗依據。方法：體 外擴增誘導兔骨髓基質干細胞，將其與去細胞牛松質骨復合培養。造成兔橈骨中段 10 mm 骨缺損模型，分復合細胞組、單純材料組、空白對照組。通過大體觀察、放射學檢查、組織學檢查觀察骨缺損的修復情況。結果：去細胞牛松質骨復合骨髓基質干細胞修復兔橈骨缺損，12 周時缺損區完全被新骨代替，骨髓腔完全通暢，優于單純材料組的修復效果，單純材

2、料組優于空白對照組。結論：去細胞牛松質骨具有良好的成骨能力，有可能成為理想的骨支架材料。【關鍵詞】  骨修復材料；去細胞牛松質骨；組織工程    Abstract    Objective     To  prepare  an  ideal  scaffold  material  for  the

3、0; repair  of  bone  defect,  for  the  clinical  use  in  the  bone  reconstruction  field.    Methods     Rabbit  marr

4、ow  stem  cells  (MSCs)  were  cultured  and  expanded  in  vitro.  The  MSCs  were  mixed  with  acellular  bovine  cancellous

5、60; bone  (ABCB).  The  rabbits  were  prepared  as  model  of  bone  defects,  divided  into  3  groups:named  complex  group, &#

6、160;acellular  bovine  cancellous  bone  group,  and  blank  control.  The  animals  were  sacrificed  and  new  bone  regeneration  in 

7、; the  defects  was  investigated  by  gross  specimen  inspection,  X-ray  examination  and  histological  observation.    Results    

8、 At  12  weeks,  the  radial  defects  repaired  by  named  complex  group,  and  their  marrow  cavities  formed,  which  is

9、  better  than  acellular  bovine  cancellous  bone  group.  Acellular  bovine  cancellous  bone  group  is  better  than  blank  

10、control.    Conclusion     Acellular  bovine  cancellous  bone  may  be  used  as  a  kind  of  ideal  scaffold  material.

11、60;   Key  Words    Bone  repair  material;  Acellular  bovine  cancellous  bone;  Bone  tissue  engineering    研制理想的生物材料替代自體骨移植用于修復骨組織缺損是醫學和生物材料

12、科學領域的一個重要課題。目前臨床上應用的骨移植物較多，如羥基磷灰石、脫鈣骨、脫蛋白骨等為臨床骨缺損的治療提供了很多選擇。但是這些方法各有優缺點，難以滿足臨床上修復各種骨缺損的需要。去細胞牛松質骨作為新型的生物衍生支架材料，具有良好的力學性質、空間結構、降解性、生物相容性等特點，日益受到重視。本研究將兔骨髓間充質干細胞（MSCs）與去細胞牛松質骨載體相結合，構建組織工程骨，探索修復兔橈骨節段性骨缺損的可行性。    1    材料與方法    1.1  &#

13、160; 材料    1.2    方法    2    結    果    2.1    原代細胞培養    原代細胞接種后，細胞漂浮在培養液表面，呈圓形，細胞 6 h 后開始貼壁，24 h 內有少數細胞貼壁，48&#

14、160;h 后貼壁細胞增多，形狀不一。約 6 d 時形成細胞集落，約 10 d 后長滿。1:2 傳代后增殖加快，細胞呈均一的長梭形，呈漩渦狀生長（圖 1）。    2.2    相差顯微鏡觀察    BMSCs 在材料上接種孵育 2 h 后，材料周邊開始有細胞黏附，隨著時間延長，附著材料上的細胞逐漸增多；培養 1 周后，細胞在材

15、料上逐漸伸出突起，連接在骨小梁之間，可見大量細胞附著于材料的孔隙及材料周邊。    2.3    掃描電鏡觀察    可見 ABCB 材料上皆有細胞附著，細胞呈梭形或多角形，有的細胞表面可見鈣顆粒沉積，有的材料上的細胞呈團簇狀，周圍有網狀膠原附著。2.4    VON Kossa 染色    顯微鏡下見誘導組細胞間可見黑色斑點狀被染色的鈣基質；未誘導組未見黑

16、色斑點狀被染色的鈣基質。    2.5    骨缺損修復實驗    3    討    論    理想的骨組織工程細胞外基質材料應具有良好的生物相容性和可降解性、合適的三維多孔結構、較強的骨誘導性、良好的可塑性和適當的機械強度，尤其是作為管狀骨的修復材料2。提供移植的材料多種多樣，但理想的骨缺損修復材料，尤其是修復大段骨缺損的移植材料仍是骨科面臨的重要課題。

17、異種骨由于來源廣泛和經濟簡便，在解剖形狀、組織結構等方面具有無法比擬的優越性，一直是骨修復工作者熱衷于研制開發的植骨材料，然而異種骨的免疫排斥反應妨礙植骨與骨缺損區域直接接觸，破壞植骨成分，導致植骨吸收。    如何消除異種骨的抗原性，同時保留其成骨能力，是異種骨移植的核心問題。羅卓荊3等通過對松質骨抗原性的研究發現，在骨小梁骨基質染色陰性，而骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞及骨陷窩等均有不同程度的陽性染色。也就是說，各種細胞成分是松質骨中抗原的主要成分。常用的去細胞方法有酶消化法、滲透溶液法和去污清洗法。筆者采用 10% 高滲生理鹽水和去

18、污劑 TritonX-100 聯合對牛肱骨進行組織工程學的去細胞處理。去細胞基質骨有效地去除異種骨引起免疫排斥反應的細胞成分，清潔骨陷窩壁，選擇性地保留抗原性相對較弱的網狀骨基質結構，降低了移植骨的免疫原性。    為了尋求理想的修復材料，課題組采用自制的去細胞牛骨作為兔骨髓基質干細胞載體復合移植于體內骨缺損處，以觀察其成骨潛能和吸收降解情況，旨在為今后的實驗和臨床應用提供依據。    MSCs 是骨髓中的一類多能干細胞，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞甚至神經細胞等多種潛能，可

19、在地塞米松、維生素 C、- 甘油磷酸鈉等誘導下向成骨細胞分化，是構建組織工程骨的重要細胞 。應用 MSCs 修復骨缺損的組織工程方法一般是將 MSCs 與支架材料復合后植入缺損區，或先將 MSCs 誘導分化為成骨細胞后再與支架材料復合并植入缺損區。我們所采用的將 MSCs 誘導分化為成骨細胞后和去細胞牛骨復合在一起的方法，此前尚未見報道。    以往的研究發現：生物衍生骨孔隙率高，可有效地為種子細胞黏附、分化和成骨提供良好場所。生物衍生骨植入骨缺

20、損區后，隨著誘導成骨作用、骨傳導作用的完成而逐漸降解，其逐步降解的特點與新骨形成的過程相吻合。本實驗中將骨髓基質干細胞誘導培養后，接種于支架材料上，植入骨缺損處，發揮其最大成骨活性。在體內微循環環境影響、應力作用及血液供應等條件下，組織工程骨可同時發揮骨傳導、骨誘導成骨作用，從而修復骨缺損。通過放射學檢查、大體觀察及組織學檢查均表明，組織工程骨的成骨及塑形能力較強。4、8 周復合細胞組有大量骨痂形成 ，12 周時骨塑形好，提示組織工程骨成骨較快，新骨塑形、改建迅速；而單純材料組只是通過支架材料的骨傳導作用促進成骨，所以新骨形成較慢；空白對照組各缺損區均未愈合。    尋找能同時滿足生物相容性良好、有利于細胞黏附生長、且有一定的孔隙率并具備相當的降解速率的生物支架材料是組織工程的重點。本文作者認為用骨髓基質干細胞復合去細胞牛松質骨構建的組織工程骨移植修復骨缺損，排斥反應少，能促進負重部位長段骨缺損修復，此方面的深入研究將為骨組織工程的臨床應用提供重要的理論依據。筆者通過一系列理化方法處理的去細胞骨，降低或消除了移植骨的免疫原性，具有良好生物相容性，但仍保留骨的天然屬