1、試驗七蛋白質含量測定測定蛋白質的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲(Biuret)法，酚試劑法(Lowry)法及紫外吸取法。目的要求1把握測定蛋白質的含量基本方法。2了解染料法、雙縮脲法、Lowry法和紫外吸取法測定原理。一、染料法試驗原理在酸性溶液中染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合，此時考馬斯亮藍G-250顏色從紅色變為藍色，吸取高峰從460nm移至595nm。利用這個原理可以測定蛋白質含量。該法近年在某些方面有取代經典的Lowry法趨勢，由于它操作簡潔，反應時間短，染料-蛋白質顏色穩定，抗干擾性強。本法的缺點是：對于那些與標準蛋白氨基酸組成有較大差異的蛋白質，有肯定誤差，由于不

2、同的蛋白質與染料的結合是不同的，故該法適合測定與標準蛋白質氨基酸組成相近的蛋白質。器材吸量管； 試管；721型分光光度計試劑1.標準牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。2.待測蛋白質溶液。3.染料溶液：稱取考馬斯亮藍G-2500.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的濃磷酸100ml，用水稀釋至1000ml,混勻備用。操作步驟1標準曲線的繪制：試劑(ml)管號012345標準蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nm按上表分別向各支試管內加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm波特

3、長以0號管調零,測定各管吸光度值（A）。以吸光度值為縱坐標,蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。2樣品測定：取1ml樣品溶液（約含25250微克蛋白質），加入染料溶液5ml混勻，5min后測定其595nm吸光度值，對比標準曲線求得蛋白質濃度。二、雙縮脲(Biuret)法測定蛋白質含量試驗原理在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(CO-NH2)，或與此相像的基團如CH2-NH2，CS-NH2，C(NH)NH2的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發生上述反應。蛋

4、白質分子含有眾多肽鍵(CO-NH)，可發生雙縮脲反應，且呈色強度在肯定濃度范圍內與肽鍵數量即與蛋白質含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為110mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要格外精確的蛋白質測定。試劑1雙縮脲試劑： 取CuSO45H20(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉(c.P.)6.0g以少量蒸餾水溶解，再加2.5molLNaOH溶液300ml，KI1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅

5、色沉淀消滅，即不能使用。2標準蛋白質溶液： 用標準的結晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10g/L的標準蛋白溶液，可用BSA濃度1g/L的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再依據其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。器材1試管：15150mm試管7只 ；21ml，5ml移液管；3坐標紙 ；4721分光光度計。操作步驟取試管7支，編號，按下表操作：試劑(ml)管號空白管12345測定管蛋白標準液（10g/L）-0.10.20.30.40

6、.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測樣品-0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當蛋白質（g/L）01020304050混勻，37水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計波長540nm處，用空白管調零，讀取各管吸光度值。15為標準曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。以測定管的吸光度，在標準曲線上求得蛋白質濃度。留意事項1雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩定的絡合銅離子，以防止CuSO45H20不穩定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO45H20之比不低于31，加入KI作為抗氧化試劑。2雙縮脲試劑要封閉

7、貯存，防止吸取空氣中的二氧化碳。3本法各種蛋白質的顯色程度基本相同，重復性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。4黃疸血清、嚴峻溶血對本法有明顯干擾。思考題1雙縮脲法測定蛋白質的原理是什么?其它還有什么方法測定蛋白質的含量?2請用雙縮脲法，設計一個測定蛋白質含量的定量方法(除標準曲線法外)。三、酚試劑法測定血清蛋白質含量（改良Lowry法）試驗原理蛋白質分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡合生成復合物產生紫紅色化合物（雙縮脲反應），同時使肽鏈開放，蛋白質中半胱氨酸、絡氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鎢酸、鉬酸同時失去1個，2個或者3個氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍顏色（最大吸取峰

8、波長為745750nm,反應式一）其藍色深淺與蛋白質含量在肯定范圍內成正比，由此可測出樣品中蛋白質的含量。同時蛋白質肽鍵發生烯醇化反應（反應式二）能使鉬離子在pH10時螯合在肽結構中，形成復合物，從而使電子轉移到混合酸的顯色劑上，大大增加了酚試劑對蛋白質的敏感性。反應式一3H2OP2O513WO35MoO310H2O3H2OP2O514WO34MoO310H2O反應式二3H2OP2O513WO25MoO310H2O3H2OP2O514WO24MoO210H2O烯醇化反應烯醇化反應后，可與Cu2+絡合，絡合后，易于使肽釋放電子，使酚試劑還原。試劑器材1堿性銅試劑：甲液：稱取無水碳酸鈉2.0g，溶

9、于0.1mol/LNaOH溶液100ml中。乙液：取硫酸銅（CuSO45H2O）0.5g，溶于1%酒石酸鉀溶液100ml中。臨用前取甲液50ml，乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。此液需現用現配。2標準蛋白質溶液（250mg/ml）：精確稱取結晶牛血清清蛋白25mg，溶于0.9%NaCl溶液中，以容量瓶定容至100ml。3樣品：取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度處，混勻，為待測血清樣品。4.酚試劑：取鎢酸鈉（Na2WO42H2O）100g和鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）25g,溶于700ml蒸餾水中，再加入85%磷酸50ml和濃硫酸100ml充分混勻，置于

10、1500ml圓底燒瓶中溫存地回流10小時，冷卻，取下冷凝裝置，再加入硫酸鋰（Li2SO42H2O）150g,水50ml,溴34滴，開口連續沸騰15分鐘，驅除過量的溴，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應呈黃色或金黃色（如帶綠色不能使用，應連續加溴煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前，以酚酞為指示劑，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃度。然后依據此濃度，將酚試劑用蒸餾水稀釋至最終酸度為1mol/L。（滴定時可將酚試劑稀釋，以免顏色影響）。試劑放置過久，變成綠色時，可再加溴數滴煮15分鐘，如能恢復原有的金黃色仍可使用。5721分光光度計；旋渦混合器；秒表；試管。操作步驟取試管7支

11、，編號，按下表操作：試劑（ml）管號O12345測定管標準蛋白溶液（250g/ml）0.20.40.60.81.0稀釋血清1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5混勻，室溫放置30min后，以0管調零點，在波長650nm比色，分別讀取各管吸光度值。以蛋白質含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。以測定管吸光度值，查標準曲線求得血清蛋白質含量。臨床意義1.血清總蛋白濃度增高：（1）血清中水分削減，而使蛋白濃度相對增高。如急性失水時（嘔吐、腹瀉、高熱）；休克

12、時，由于毛細管通透性的變化，血漿也發生濃縮等。（2）蛋白合成增加，大多數發生多發性骨髓瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2血清蛋白合成降低：（1）合成障礙，主要為肝功能障礙，肝臟是合成蛋白質的場所，肝功嚴峻損害時，蛋白質的合成削減，以白蛋白最為顯著。（2）蛋白質丟失，如嚴峻灼傷時，大量血漿滲出；腎病綜合癥時，尿液中長期丟失蛋白質等。（3）養分不良或長期消耗性疾病，如嚴峻結核或長期消耗性疾病。（4）血液中水分增加，血漿被稀釋，因各種緣由引起的水鈉潴留或輸注過多低滲溶液。留意事項1.酚試劑在酸性條件下較穩定，而堿性銅試劑是在堿性條件下與蛋白質相互作用，所以當加入酚試劑后，應快速搖勻（加一管搖一管），

13、使還原反應發生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。2.堿性銅試劑必需臨用前配制。3.磷鉬酸、磷鎢酸的顯色反應是由于和還原物質的還原反應而引起的，因此本法可受很多還原性物質的干擾，如帶有-SH的化合物，糖類、酚類等甚至有些緩沖劑（如Tris）也能干擾測定。但如把握在低濃度范圍內，則不影響測定，Lowry法很靈敏，可以對5100g蛋白質樣品進行很好的顯色反應，而如此低的蛋白質濃度經常已把干擾物質的濃度稀釋到一個不起作用的水平。4.全部器材必需清洗潔凈，否則影響試驗結果。5.血清稀釋的倍數應使蛋白質含量在標準曲線范圍內，若超過此范圍需要將血清酌情稀釋。6.本法操作簡便、靈敏度高，缺點是試劑只與蛋白質中半

14、胱氨酸、色氨酸等起反應，因此可因各種蛋白質中含這幾種氨基酸的量不同使顯色強度稍有不同。思考題1.用酚試劑法測定蛋白質含量有哪些優點？2.用酚試劑法測定蛋白質含量有哪些干擾作用？應如何留意？四、紫外吸取法試驗原理蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸取紫外光的性質。吸取高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸取值與肽鍵含量成正比。利用肯定波長下，蛋白質溶液的光吸取值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。紫外吸取法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用

15、的（NH4）2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特殊適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，由于此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其確定值。此法的特點是測定蛋白質含量的精確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有肯定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相像的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸取紫外光的物質，會消滅較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是由于不同的蛋白質和核酸的紫外吸取是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在肯定的誤差。此外，進行紫外吸取法測定時，由于蛋白

16、質吸取高峰常因pH的轉變而有變化，因此要留意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相全都。試劑器材1蛋白質標準液（1mg/ml）： 精確稱量經微量凱氏定氮法校正的標準蛋白質配制。2紫外分光光度計。操作步驟1.標準曲線的繪制：取8支試管，按下表編號并加入試劑：試劑（ml）管號01234567蛋白質標準液（1mg/ml）蒸餾水04.00.53.51.03.01.52.52.02.02.51.53.01.04.00混勻。在280nm處測定各管溶液的吸光度值。以0號管調零，以蛋白質溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出蛋白質標準曲線。2.蛋白質樣品溶液，在280nm處測得吸光度值，從

17、標準曲線上查出其濃度。留意事項1.蛋白質的最高吸取峰可因pH的轉變而發生變化，因此要留意保持待測蛋白質溶液的pH值與標準蛋白質溶液全都。2.測定液必需澄清，以免造成結果誤差。3本法需用石英比色杯。思考題1為什么紫外吸取法可作為蛋白質定量測定方法？其理論依據是什么？2此法測定蛋白質具有什么特點？試驗二十一 紫外光吸取法測定蛋白質濃度目的和要求了解紫外吸取法測定蛋白質濃度的原理。生疏紫外分光光度計的使用。原理蛋白質組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波特長有最大吸取峰，肯定濃度范圍內其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質的含量。由于核酸在280nm波

18、特長也有光吸取，對蛋白質測定有肯定的干擾作用，但核酸的最大吸取峰在260nm處。猶如時測定260nm的光吸取，通過計算可以消退其對蛋白質測定的影響。因此如溶中存在核酸時必需同時測定280nm及260nm的吸光度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質濃度。操作步驟一.直接測定法在紫外分光光度計上，將未知的蛋白質溶液當心盛于石英比色皿中，以生理鹽水為對比，測得280nm和260nm兩種波長的吸光度（A280nm及A260nm）。將A280nm及A260nm波特長測得的吸光度按下列公式計算蛋白質濃度。C= 1.45A280nm 0.74A260nm式中C：蛋白質質量濃度（mg/ml）；A280nm：蛋白質溶液在280nm處測得的吸光度；A260nm：蛋白質溶液在260nm處測得的吸光本法對微量蛋白質的測定既快又便利，它還適用于硫酸銨或其他鹽類混雜的狀況，這時用其他方法測定往往較困難。為便利起見對于混合蛋白質溶液，可用A280nm乘以0.75來代表其中蛋白質的大致含量（mg/ml）。（二）標準曲線