1、體外循環血漿對體外培養人臍靜脈血管內皮細胞鈣池操縱的鈣通道電流的影響 作者：汪進益，范慧敏，張旭敏，盧蓉，李健，劉中民【摘要】 目的 探討經體外循環(cardiopulmonary bypass,CPB)后人體炎性血漿對體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞(Human Umbilical V Ei n Endothelial Cells, HUVECs)的鈣池操縱的鈣通道電流(store-operated Ca2+ currents, Isoc)的影響。方法 CPB后血漿采自我科心血管外科手術患者，患者均知情同意。將已培養好的HUVECs按所加入的血漿不同分為4組，每組6例：即組 (加入CPB剛開始

2、0 min時血漿的對照組)、組 (加入CPB后25 min的血漿)、組(加入CPB后50 min的血漿)及組(加入CPB后50 min含左旋精氨酸的血漿)。 應用 全細胞膜片鉗記錄技術測定并觀察各組HUVECs的Isoc變化。結果 在HUVECs上可記錄到Isoc；當鉗制電位為-100mV時，組組中HUVECs的Isoc分別為(-302.3835.13) pA、(-388.5958.66) pA、(-577.0493.69) pA及(-365.4234.79) pA，各組比較差異有 統計 學意義(P0.05或P0.01)，其中組明顯低于組(P0.01)。結論 CPB后人體炎性血漿可增強血管內皮

3、細胞的鈣通道電流，左旋精氨酸可減輕此作用，這對于進一步深入研究CPB圍術期血管內皮細胞鈣超載的發生機制和防治具有重要意義。 【關鍵詞】 體外循環; 血管內皮細胞; 鈣池操縱的鈣通道電流; 膜片鉗技術 Abstract: OBJECTIVE To observe the effect of inflammatory plasma on store-operated Ca2+ currents (Isoc) of human umbilical v EI n endothelial cells (HUVECs) cultured in vitro after cardiopulmonary byp

4、ass (CPB) in cardiovascular surgery. METHODS The plasma was collected from patients of Department of Cardiac Surgery, Shanghai East Hospital Affiliated Tongji University. The patients all knew the program and agreed with. The randomly selected HUVECs were divided into four groups with same culture c

5、ondition: Group (control group adding the plasma after 0 min CPB), Group (adding the plasma after 25 min CPB), Group (adding the plasma after 50 min CPB) and Group (adding the plasma with L-arginine after 50 min CPB). The Isoc of HUVECs in each group was determined by whole cell patch-clamp techniqu

6、es. RESULTS The dynamic changes of the Isoc of the single HUVECs was determined by tight-seal whole-cell patch-clamp techniques. At the potential of -100 mV, the peak amplitude of Isoc of HUVECs were (-302.3835.13) pA, (-388.5958.66) pA, -(577.0493.69) pA and (-365.4234.79) pA, respectively in these

7、 groups. The Isoc was significantly lower in the control group than in other groups (P0.05 or P0.01). It was distinctly lower in the Group than in the Group (P0.01). CONCLUSION The injury and activation of vascular endothelial cells can be widely induced by CPB which could markedly potentiate the pe

8、ak amplitude of Isoc in a dose-dependent manner, but L-arginine can attenuate this process. Key words： Cardiopulmonary bypass;Vascular endothelial cells;Store-operated Ca2+ currents;Patch-clamp techniques 血管保護是體外循環(cardiopulmonary bypass, CPB)過程中的一個重要組成部分，近年來的研究表明，血管內皮細胞不只是血液與間質 組織 間的屏障，還具有接受和傳遞信息以及

9、內分泌功能1。Ca2+ 作為細胞內第二信使，在維持細胞代謝、增值、分裂和凋亡、Ca2+ 依賴蛋白激酶和磷脂酶的激活、胞外分泌及基因調控等多種過程中具有重要的作用。血管內皮細胞等非可興奮細胞內Ca2+ 濃度維系的主要途徑是鈣池操縱的Ca2+ 通道(store-operated calcium channels，SOC)，即Ca2+ 內流是通過細胞內興奮劑敏感性鈣池中Ca2+ 濃度調節的2-5。本實驗采用人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)培養的方法，應用膜片鉗技術研究CPB后炎性血漿對HUVECs胞膜上SOC電流(s

10、tore-operated Ca2+ currents, Isoc)的影響，以進一步豐富CPB中有關血管保護研究的電生理特性及病理生理的機制理論。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 CPB血漿采自我科心血管外科手術患者，胎兒臍帶取自我院產科，患者均知情同意。DMEM培養基、胎牛血清(GIBCO)；混合膠原酶、胰蛋白酶(Sigma)；因子單克隆抗體、SABC試劑盒(武漢博士德公司)；Egtazic acid (AMERSCO)，谷氨酸鉀、Mg-ATP(Sigma)。玻璃電極(Would Precision, USA)，Axopatch 200B膜片鉗放大器(AXON INSTRUMENTS,US

11、A)，MP-285三維微操縱器和MODELP-97微電極拉制器(SUTTER INSTRUMENT Co., USA)，Zeiss Axiovert 200倒置顯微鏡(ZEISS, USA)，H6024-240微電極拋光儀(WPI, INC Sarasota, Fl, USA)，RSC-200快速加藥灌流裝置(Biologic Science Instruments, USA)。 1.2 實驗方法 2 結 果 2.1 HUVECs的原代培養和鑒定 HUVECs在原代培養1 d后，可以見到細胞均貼壁伸展，成片生長，呈短梭形、短圓形或多角形，長多角形不規則細胞突起，細胞之間緊密銜接，連接成片，78

12、 d后呈鋪路石樣；因子免疫組化染色陽性。 2.2 CPB患者血漿對HUVECs胞膜上Isoc的影響 HUVECs胞膜Isoc 全細胞膜片鉗記錄形成后，利用Ca2+電流鉗制方案，即：鉗制電位保持在0 mV時，各實驗電位(TP)從100 mV至80 mV連續刺激200 ms，刺激波寬20 mV，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到明顯的Isoc，且該電流可穩定維持不少于5 min而未出現Rundown現象。按實驗要求加各組血漿作用后可記錄到隨著血漿的不同而出現不同程度改變的電流。見圖1（各組電流圖正上方的矩形圖為階躍指令電位模式圖。 AD分別為組組）。 當膜電位鉗制于-100 mV時，對照組HUVECs胞膜Isoc 的峰值電流為(-287.3723.03) pA；在CPB炎性血漿作用下，CPB后25 min血漿組、CPB后50 min血漿組及CPB后50 min含L-arg血漿組HUVECs胞膜Isoc 的峰值電流分別為(-302.3835.1