1、產腸毒素性大腸桿菌疫苗研究概況郭樂李敏王玉炯（寧夏大學生命科學學院西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）摘要產腸毒素性大腸桿菌（簡稱ETEC）是引起仔豬腹瀉的主要病原之一。在家畜中，尤以初生幼畜特別易感，并引起生長發育遲緩，生產能力低下，甚至造成死亡，給畜牧業造成很大損失。ETEC腸毒素基因和菌毛蛋白（黏附素）基因對于ETEC的致病性起主要作用。除了滅活疫苗、減毒疫苗、結合多糖疫苗和亞單位疫苗外，新近出現的DNA疫苗、轉基因植物疫苗為疫苗的研制提供了新的思路。本文概述并評價了各類產腸毒素性大腸桿菌疫苗，并簡要介紹了產腸毒素性大腸桿菌疫苗最新的進展。關鍵詞：產腸毒素性

2、大腸桿菌；腸毒素；菌毛蛋白基因；DNA疫苗；轉基因植物疫苗大腸桿閑是動物腸道中的正常慵群之一，可以分為致病性和非致病性兩大類。在通常情況卜，大腸肝陶并不引起疾病，因此人們最初認為大腸桿菌是動物腸道中的正常菌群。直到1885年Eschcrich首次從嬰兒腹瀉物中分離出大腸桿倘后，才開始認識到其致病性。致瀉性大腸桿謂是引起人畜腹瀉的致病性大腸桿菌的通稱，主要包括腸致病性大腸肝菌（EPEC）、腸出血性大腸桿曲（EHEC）、腸侵襲性大購桿曲（EIEG）和產腸毒性大腸桿偏（ETt：C）o而產腸毒素性大腸桿俏（ETEC）是引起小兒腹瀉的主要病原的之一，也是旅游者腹瀉的病原慵，能引起嚴重的霍亂樣腹瀉，同時產

3、腸盤素性大腸桿菌也可引起仔豬黃虬犢白痢和羔羊下痢°據估計，國內約有35%的仔豬腹瀉是由ETEC引起的口；美國等國家新生仔豬腹瀉中.由ETEC引起的占45%以上兩。目前，該病的防治以藥物和疫苗為主。藥物治療有較多的弊端.免疫預防才是控制該病的依佳選擇。目前，國內外已有多種預防仔豬腹瀉的實臉性或商.品化菌苗.大體上可分為以抗黏附素免疫為基礎的傳統黏附素類疫苗；以抗腸毒素免疫為主的傳統腸毒索類疫苗；表達-種或幾種狩附素以及同時表達黏附素和腸毒素的基因工程萌苗等。用這些慎苗免疫懷孕母畜后，均能使其仔豬獲得一定的保護。本文擬對這一方面的研究進展作-概述。1傳統聒附素類疫苗黏附素（adhesio

4、n）是ETEC弟體表面的一種纖毛樣突出物，能與宿主小腸上皮細胞刷狀緣相應受體結合，細曲在腸黏膜上黏附、定居、繁殖，井產生腸毒素，導致腹瀉同。迄今，已發現的ETEC黏附素抗原有K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F41.F42、F165、7和F18%而且還會不斷有新的黏附素抗原被發現。這里所指的黏附素類疫苗.即以上一種或兒種黏附素作為免疫原而制成的疫苗，包括全藺苗或亞單位全菌苗即是細菌培養好后不需要提取黏附素，用全倆體弱毒活葡或火活保i配置的疫苗。全菌苗主要地指用本豬場病曲制備的自家疫苗，目前國內多采用這種方法，其優點右以F幾點。1.1全菌苗的優點全儒苗主要是指用本豬場病菌制備的自

5、家疫苗，目前國內多采用這種方法，其優點有以下兒點。1.1.1俏株來自于本場.針對性強。1.1.2方法簡便、經濟實用，免疫效果確實。其典型代表為中國獸醫藥品監察所研制的仔豬大腸埃希氏弟病三價滅活苗。1.2全菌苗的缺點全御苗的優點勿庸置疑，但是，全倆苗也有很多缺陷。1.2.1全曲苗雖然針對性強，但是應用范圍十分狹窄.常僅適用本豬場。1.2.2在疫病開始流行后去分離ETEC,并制成自家苗去免疫妊娠母豬，往往為時已晚。1.2.3黏附素抗原的編碼基因在人工培養時不易表達或表達扯很低，很難達到理想的濃度。因此，制造此類疫苗時，為提高黏附索抗原的含址需進行濃縮.濃縮使菌體的濃度相對升高.同時也使疫苗中的內毒

6、素含址升高，影響疫苗的安全性。1.2.4全菌苗濃縮后干物質較多，造成疫苗注射困難，H.不易加入其他抗原制成聯苗.亞單位苗即純化黏附素苗，可以基本克服這些缺陷。制備此類疫苗時，通過不同方法提取黏附素，經過純化后用于配制疫苗。目前，國內已有數種實驗性或商品化單價或多價純化黏附素苗也氣但此類疫苗生產工藝復雜，成本也高。2傳統腸毒素類疫苗ETEC黏附索具有很多種，而腸毒素僅有熱蝮腸毒素（heat-labileenterotoxin,LT）和耐熱腸毒素（heat-stableenterotoxin,ST）兩種，用LT和ST制成的二聯苗可通用于各種菌型。LT分子由A亞基（LTA）和B亞基（LTB）組成，S

7、T可分為ST1（乂稱STa）和STII（又稱STb）0LTA具有生物毒性.LTB只有免疫原性，而相對分予仙較小的ST需與大分子lit的裁體蛋白相聯接才會具有抗原性。Klipslein等""曾用化學偶聯法將STI多肽與某些大分子蛋白質融合，免疫動物后得到r抗STI抗體。Frantz等將合成的STa偶聯到載體蛋白上，加弗氏佐劑免疫時豬，產生的抗體高峰期可維持兒周，使新生動物對ETEC的攻擊產生保護作用。Iloughten等采用了Chan等18線基酸ST和Dallas等報道的LTB的第53183位釵基酸片段進行偶聯，結果表明：ST與LTB的抗原性均降低50%o用CH0細胞、乳鼠及

8、鼠腸祥結扎試駛均證實無毒性，LT腸內分泌刖IgA效價隨免疫劑做增加而增加.并與ST具有同等的免疫保護性，說明部分K度的LTB對ST在融合蚩白分子中的免疫原性更小，從而使融合蛋IT表現出更強的ST免疫原性，這對于進一步闡明融合各部分間的影響是很有意義的。但是，人I：合成的多肽與蛋門質的偶聯，價格昂貴，操作困度.而且在這種融合物中，ST的毒性僅僅是降低而不是完全消失,并且這僅是一種蛋白質抗原，為“死苗”.相對于活倒苗來講，無疑是其弱點。隨著基因工程技術的成熟及X寸腸毒素基因結構本質的r解，采用分子生物學手段.將CTB或I.TB與ST的基因融合來制備疫苗候選株已成為現實。與早期的化學偶聯法相比.基因

9、融合的方法可更精確地定位，以及方便地加入融合體之間的銜接物。銜接物有時對雙抗原的空間構象具有重要作用.可顯著地影響抗原的雙功能抗原性和免疫原性。3基因工程疫苗引起仔豬腹瀉的ETEC有三種可用于構建基因工程疫苗的抗原.即ST、LT和黏附素抗原。產腸毒素基因工程活即疫苗相對傳統產腸毒素疫苗有很多的優點：產腸維素基因工程活菌疫苗是用細倆作為活載體，來延長在小腸內相關的淋巴組織駐留時間，并表達不同的黏附素和類毒素抗原，這些載體允許在一劑疫苗中存在多種抗原，達到“一針多防”的預防效果；產腸毒素基因工程活菌疫苗成本低廉，貯存穩定性好便于調配，產生的免疫刺激與病原菌最為接近；產腸毒素基因丁程活角疫苗可以彌補

10、傳統產腸毒素疫苗的很多不足，即傳統產腸俗素疫苗的致病物質在疫苗生產過程中有可能沒有完全殺死或充分政毒，這會導致疫苗中含有強毒性致病物質，進而使得疾病在更大的范圍內傳播，減毒的株可能發生突變。所以采用基因工程手段，以ETEC黏附素或者ETEC腸毒素作為抗原.以細倘為載體，構建口眼活茵疫苗開始引起普遍關注。3.1黔附素基因工程疫苗國外學者已成功研制了K88、K99.987P和F41的四價基因工程苗。我國也先后研制成功K88、K99-987P及K88-K99等的基因工程苗，并在臨床應用上取得較理想的效果。張景六等將已構建的K88基因工程俏的質粒pTK90和K99基因工程質粒pTK56-l用Bamli

11、I處理，再用T4DNA連接協連接，轉化E.coliC600株，獲得了帶有pTK8899-1質粒的菌株，又將PTK8899-1DNA用BamHI處理除去多余的序列，構建出既表達K88又表這K99的戲價基因工程疫苗。試驗表明：用此基因工程疫苗免疫妊娠母豬后，乳汁中K88、K99的抗體效價很高，能有效的中和黏附素抗原，阻止仔豬的下痢，劉興漢等利用基因工程技術構建的帶有K99和F41兩種纖毛抗原基因的.取組質粒與K88抗原工程菌C84的質粒轉化同一受體菌，得到雙質粒。同時，表達KB8、K99、F41三種纖毛抗原的菌株。用小鼠實驗初步證實，該菌株生物學性質穩定，對動物安全，對K88、K99和F41強毒菌

12、的攻擊具有較強的保護作用。3.2腸毒素基因工程疫苗成熟的大腸桿菌STI為18-19知基酸的多肽.含有13個高度保守的基基嗾序列（517敏基酸），保守區內的6個Cys組成Cys5-CyslO、Cys6-Cysl4和Cys9-Cysl73個分子內二硫鍵，其中Cys6-Cysl4組成的二硫鍵與ST【毒性有關而最為重要.其他2個二琉健在維持分子結構上起作用，從而使STI成為完整的結構。單獨LT并不能產生完全的保護，所以人們更多地是將ST與LT共同作為抗原進行免疫。用DNA重組技術產生融合蚩白，使STI多肽能誘發抗體產生.從而使免疫動物產生保護作用。由于它比化學偶聯法具布一系列優點，如其有可以準確定義的

13、蛋白質結構，以及可以通過口服疫苗的方式接種抗原等，因此這是-條更為有效的途徑。Aitken等報道將編砰STI前體蚩白（53肽.Prol9-STI）的基因片段與LTB基因的3'末端相融合，所產生的LTB-pre-STI融合蛋白其有免疫原性，并引起免疫應答，而旦融合蛋白STI的生物毒性下降至原ST【的0.7%左右。他們乂將另一STI前體蛋白(23肽，Gly49-STI)的基因片段與LTB基因的3'末端相融合.所產生的I.TB-pre-STI械合蛋白具有免疫原性，并引起免疫應答，但融合蛋白STI的生物毒性高于前一種構建方式。Clements用基因融合的方法把STI的結構基因片段(Se

14、r54-Val72)連在LTBM因的下游旦處于同一個閱讀框架內，構建出3種不同的LTB-STI融合基因。經ELISA檢測表明均能表達LT,但Sr的表達水平不一。二者之間插入7個耍基酸(Asn-Pro-Arg-Vai-Pro-Ser-Ser)時，ST的表達水平最高；當插入3個敏基酸時(Tle-Pro-Gly)時，ST表達次之；當不插入鬣基酸時，用ELISA方法沒有檢測到ST的存在。表達水平最高的童組菌株較好地解決了ST1的免疫原性較低的問題，并且幾乎消除了STI的毒性。張兆山等采用不耐熱腸毒素LTB亞單位基因作為裁體分子，將編碼STI抗原決定簇的'穿核昔酸連接在消除了終止密瑪子的LTB基

15、因下游，并使之處于同一開放閱讀框架中，構建了3種不同的STI-LTB融合基因。核昔酸序列分析證實該融合基因有正確的閱讀框架，ELISA檢測&明，這些融合基因既能表達LTB.也能表達STI。當LTB基因和ST結構基因之間插21bp的賓核昔酸時，ST的表達水平最高，比野生俏株高8倍以上；當兩者之間插入9bp的寡核昔酸時的Linker時，ST表達次之，是E.coliHl0407菌株的3倍左右；二者相隔33bp時，ST的表達水平與野生菌株相近。Western-blot-ting試驗顯示了ST-LTB融合賀白的存在，但該融合蛋白依然還具有"ST毒性。許崇波等將2個含寺突變堿基的STI基

16、因(毒素活性部位的第4個CysSer)相連后，再與LTB基因融合，并置于17啟動子下進行表達，結果得到了既能高效表達STI,乂能高效表達LTB的STI-LTB融合賀白，其表達量:占菌體總賀白的33.21%,且能夠誘導乳鼠產生抗STI的抗體。葛艷等以pET32a質粒為克隆載體，構建了含有LTB亞單位基因和ST、STII結構素白基因的pBST重組質粒。垂組工程菌BL21(DE3)RIL(pBST)表達的融合錢白經SDS-PAGE分析，其分子缺約40kI)oBingX等利用重組DNA技術，構建了ETECLTB與ST的融合基因。通過PCR擴增編碼成熟ST序列的pro-ST基因和編碼ST前體蛋門質的序列

17、，然后通過5個或9個linker將編碼pro-ST的5'端基因融合到3'端LTB,其中為了減少ST的毒性將ST14位Leu突變為Ala。試驗表明，LTB/pm-ST融合多肽具有免疫原性和與GM1神經$節脂接合的能力。雖然STI與LTB基因的敞合不僅可以增強STI的免疫原性而且能有效降低其生物毒性，給幼備基因工程亞單位疫苗研制開發以新的啟示。但是腸毒素基因工程疫苗的研制過程中仍然存在著許多的難點和不足，主要有以下幾點：解決ST的生物毒性的同時.如何增強LT、STI二者的免疫原性問題，STI的抗原決定簇與生物毒性中心位于同一個區域，這就提出了一個挑戰性的問題，既能保證STI的免疫原

18、性又要喪失其生物毒性。如何降低LTB與STI融合基因二者之間的相互影響，使構建的亞單位疫苗LTB與STI均具有高的免疫原性。STI是18或19個疑基酸的小肽，通過與作為載體的LTB串聯可堆強其抗原性s在一定程度1：講，STI串聯的拷貝數越多其抗原決定簇越多，相應的免疫原性就強.但是ST串聯后的克隆產物ELISA檢測LT活性逐漸減弱，說明ST與LT之間存在著相互的影響。可能的原因除了基因表達的影響外.與M接相連的ST與I.TB妨礙了蛋白折件過程中相互抗原部位的表卷也有關。對進一步減弱其相互間的影響作用尚需進一步的探討。今后XJST、LT的研究方向是進一步從分子角度闡明ST、LT致病機理，明確ET

19、EC產生的ST,LT與腹瀉的關系，深入對ST與LT微合基因的研究.研制出更為有效的基因工程疫苗。同時積極探索LT的免疫佐劑作用，譜寫免疫佐劑的新篇章。3.3勃附素與腸毒素聯合基因工程苗荷蘭首先用基因工程方法制成了K88-LT疫苗投放市場，成為世界上第一個用基因工程方法制成的商品化疫苗。李豐生等將已克隆的K88ac抗原基因的pPMM031質粒和LTB抗原基因的pPMC40質粒用BamHI限制性內切酶進行切割和重組，獲得了同時具有2種抗原基因的質粒pMM080,導入E.coliC600,K88ac和LTB的產瓦與親本株基本相同。在全國60多個豬場試驗，證明安全、無毒，發病率和死亡率都有明顯的降低。

20、韓文瑜等用質粒轉化技術，把K88ac-LTB基因轉入到豬很亂沙門氏慎弱毒株中，轉化的破株既具有沙門氏菌抗原性，又能高效、穩定地表達K88ac和LTB兩種抗原，為聯苗的研制提供了思路。許崇波等利用PCR技術，從大腸桿藺C83902質粒中擴增出K88ac基因、STI突變基因和LTB基因，通過分離、純化、內切酶醒切、連接和轉化，構建了含K88ac-STI-LTB融合基因表達載體的取組菌株BI21(DE3)(pXKST3LT5)。經酶切鑒定和DNA序列分析證實，構建的重組質粒pXKST3LT5中含有K88ac-STI-LTB融合基因，且基因序列和閱讀框架均正確”經ELISA檢測，重組菌株表達的K88a

21、c-STI-LTB融合蛋白能夠被STI單抗LTB和K88ac抗體識別。經乳鼠灌刊試驗證實，表達的融合蛋白已喪失天然STI腸毒素的活性。免疫試驗結果表明，K88ac-STI-LTB融合蛋白能夠誘發小鼠產生抗體，該抗體R有中和天然STI腸毒素的毒性作用，表明構建的再組萌株可以作為預防仔豬黃、白痢基因工程菌苗的候選菌株。3.4植物疫苗ETEC是為經黏膜感染的細菌“而眾所周知：黏膜是阻擋病原體與機體接觸的第-道餅障.如何有效啟動機體的黏膜免疫，就成為預防這些細菌感染的關鍵，一個理想的疫苗必須能有效啟動機體的黏膜免疫。植物基因轉化技術的發展和完善為上述問題的解決提供了途徑。與傳統的亞單位疫苗表達系統，如

22、細菌、醉母和哺乳動物細胞系統相比，植物表達系統只有能有效啟動黏膜免疫、安全、生產成本低廉、汽接口服、劾于儲藏運輸等優點，是疫苗的發展方向。植物疫苗就是將某種抗病基因轉入植物中，通過食用作物使動物獲得免疫。隨著基因工程技術的快速發展，人們巳經能夠有效的將免疫原基因轉到食用的植物中并在果實內表達，用于疾病的預防和治療，即可食用植物疫苗，如：馬鈴碧，西紅柿、蘋果等。這類疫苗成本低，預防接種經濟、方便。Haq等使大腸桿博不耐熱腸存素LTB表達于煙草和馬鈴薯中。2002年.A.M.Walmsley等在轉基因西紅柿中成功表達一個融合蛋白.該融和蛋白由一個產腸毒素大腸桿菌熱不穩定性腸毒索B亞基(LTB)和一

23、個有免疫避孕功效的蛋白構成；該融合安白的LTB部分保持有和神經節昔脂相結合的活性。2005年，Piller等發展了表達大腸桿菌K99fimbriae的轉基因大豆，小鼠口服后能產生抗原特異的高水平抗體和CD4(+)T淋巴細胞。2007年，SergioRosales-Mendoza等將LTB在胡*卜中成功表達，通過免疫原性研究發現該轉基因胡蘿卜表達的LTB,不僅有其正確的折合結構而U具有生物活性，可以用來預防大腸桿菌性腹瀉。目前的研究改點在于開發出一種能生吃的植物，如水果，并且盡量提高蛋白的表達鼠。這樣才能使轉基因植物疫苗的臨床應用成為可能。現在有人已經將ETEC的LTB基因轉入蕃茄植物中，雖然香

24、蕉是最理想的植物疫苗對象，但是還吊i待于技術上的突破，4展望ETEC疫苗發展已有20多年，盡管研制有多種疫苗，但遺憾的是至今沒有一種能完全地解決ETEC的免疫原性問題。主要是因為ETEC、0、K抗原種類多和區域分布差異，導致多價疫苗研制困難。由于ETEC腹瀉是由黏附素和腸癥素共同作用產生的，所以無論是純化的黏附素疫苗還是腸毒素疫苗，其免疫性必定是不完全的。隨著現代分子生物學和免疫學的發展，為研制右效的ETEC多價疫苗提供了先進的理論和技術支持，加速了現存ETEC疫苗的完善和基因工程疫苗的發展。基因工程苗能很好地解決ST的免疫原性問題又能去除LTA的毒性，是ETEC疫苗研究的一個方向。新興的基因

25、工程苗對傳統疫苗已經構成了一種挑戰.它克服了減本、滅活疫苗的潛在致病性和亞單位疫苗免疫反應的不完全性等缺點，訶表達經修飾的天然抗原，誘導機體產生全面的免疫應答，適于制備多價苗，既訶預防.又能治療.一次免疫劑址即W產生有效的免疫反應，此外它還具有生產簡便、成本低廉、穩定性好、貯運方便等優點。然而，目前對各種實驗性或商品性ETEC疫苗使用的效果表明，常規苗的免疫效果優于基因工程苗。在常規苗中，多價黏附素茵苗的免疫效果優于單價黏附索慎苗,腸毒素苗坦然可使免疫動物同時抵抗眾多黏附素型ETEC攻擊，但效果不及黏附索曲苗。所以選取流行性秘附素株研制多價疫苗仍然是防制仔豬大腸桿曲性腹瀉的有力武器。雖然現在對仔豬腹潸性大腸桿簫黏附索的研究已經闡明了黏附素與受體特異性黏附的機理以及黏附素的致病機理等問題，但是不同黏附素存在比例隨時間和地點發生變化的原因，以及如何通過基因工程手段改變受體控制基因，從而改變黏附素的特異性黏附等問題尚不清楚。這些間題的閘明，將對臨床防治仔豬大腸桿菌性腹瀉具有柬要意義。隨若大腸桿菌基因組和坂白質組學研究的進展,對細曲基因組結構和功能的深入認識將有助于了解此曲的感