1、ingeneexpressionpatternsinhumancancercelllinesfj.NatGenet,2000.24(3)：227-235.3SimpsonRJ,BernhardOK»GreeningDW,etal.Proteomicsdrivencancerbiomarkerdiscovery：lookinglothefuturclJ.CurrOpinChemBioL2008»12(l)：72-77.4RabilloudT.Two-dinicnsionalgelelectrophoresisinproteomics：old,oldfashioned,buti

2、tstillclimbsupthemountains.Proteomics,2002»2(1)：3-10.5jMoritzRLJiH,SchutzF,etal.Aproteomcstrategyforfractionatingproteinsandpeptidesusingcontinuousfreeflowelectrophoresiscoupledoff-linetoreversed-phasehigh-performanceliquidchromatographyJ.AnalChem*2004,76(16):4811-4824.i 6BjorhallK«Milioti

3、sT,DavidssonP.Comparisonofdiffer-entdepletionstrategiesforimprovedresolutioninpro-tcomicanalysisofhumanscrumsarnplvs)J.Proteomics,2005.5,307-317.7GongY.LiX,YangB,etal.DifferentimmunoaffinityfractionationstrategiestocharacterizethehumanplasmaproteomeCJj.JProteomcRes,2006,5(6)：1379-1387.81ZhangH,YiEC.

4、LiXJ*etal.HighthroughputquantitativeanalysisofserumproteinsusingglycopeptidecaptureandliquidchromatographymassspectrometryJJ.MolCellProteomic3t2005»4：144-155.9 BernhardOKKappLA,SimpsonRJ.Enhancedanalysisof(hemouseplasmaproteorneusingcysteine-containingtryp(icglycopepiidcsJJ.JProteomcRes.2007,6:

5、987-995.10 XuG.XiangCQ.LuY.etal.ApplicationofSELD1-TOF-MStoidentifyserumbiomarkersforrenalcellcarcinomaCJJ.Cancer1,31.2009,282(2)：2O5-2】3.11 AhnSM.SimpsonRJ.lk)dyfluidproteomics：prospectsforbiomarkerdiscoveryCJ.Proteomics-CiinApp【，2OO7,1.1004-1015.12|HuSJ-ooJA.Wongl)T.Humanbodyfluidproteomea-nalysis

6、)Jj.Proteomics,2006,6:63266353.13 ChenR,PanS,CookeK,etal.Comparisonofpancreaticjuiceproteinsfromcancerversuspancreatitisusingquantitativeproteomicanalysis。.Pancreas,2007,34：70-79.14 SilekB,LuttgesJ,MarcusK,etal.Applicationoffluorcsccnccdifferencegelelectrophoresissaturationlabellingfortheanalysisofm

7、icrodissectcdprecursorlesionsofpancreaticductaladenocarcinomaJ.Proteomics.2005,5:2665-2679.15 SardanaG«MarshallJ.DiamandisEP.Discoveryofcandidatetumormarkersforprostatecancerviaproteomica-nalysisofcellculture-conditionedmcdiumJ.ClinChem,2007,53:429-437.16 VolmerMW,StuhlerK,ZapatkaM,etal.Differe

8、ntialproteomeanalysisofconditionedmediatodetectSmad4regulatedsecretedbioniarkersincoloncancerJ.Pro-leomics,2005,5：2587-2601.17 ChevalletM.DiemerH.VanDorsscalcrA,c(al.Towardabetteranalysisofsecretedproteins：theexampleofthemyeloidcellssecretome|JJ.Proteomics.20077:1757-1770.18 KimSW,ChconK«KimCH&

9、gt;ctal.Proteomics-basedidentificationofproteinssecrciedinapicalsurfacefluidofsquamousmetaplastichumantracheobronchialepithelialcellsculturedbythreedimensionalorganotypicairliquidinterfacernethodLJl.CancerRes,2007.67：6565-6573.I19JKulasingamV,DiamandisEP.Proteomicanalysisofconditionedmediafromthreeb

10、reastcancercelllines：amineforbiomarkersandtherapeutictargetsJ2.MolCellProteomics2007,6:1997-2011.(收稿日期,200912-30)以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服疫苗研究進展王冠宇'，梁立敏'綜述，夏民杰z審校（1.解放軍第四五四醫院檢驗科，南京210002；2. 南京醫科大學基礎醫學院210000）【關鍵詞】傷寒沙門菌；或體；口服疲苗中圖分類號：R969.4文獻標志碼：A文章編號：1672-9455（2010）09-0871-04據估計，人類傳染痢的90%起始于黏膜表面.病原體通過黏

11、膜入侵人體。黏膜是人體因有性免疫系統中很重要的防止病貌微生物人侵的生理屏障，除了黏膜本身特性所形成的物理屏障外，黏膜的免疫系統發揮r極其重要的作用。為了防止感染，誘導券膜表面產生sigA是非常重要的，而大多數皮下或肌肉給藥方式的疫苗通常無法誘導黏膜sigA抗體的產生.口服活菌疫苗.可刺激黏膜淋巴細胞分泌sigA,形成一道屏障，能有效地防止經黏膜感染的微生物在黏膜表面定居和對宿主細胞的侵襲。傷寒是由傷寒桿圓引起的急性腸道傳染病.主要經糞-口途徑傳播，水和食物污染是爆發流行的主要原因.1892年首次從鼠身上分離出鼠傷寒沙門弟（SD.1893年證實St可引起人食物中推，明確St訶使人、鼠共同致病之后

12、研究者發現,減毒沙門的，尤其是減毒St,可用作攜帶異源抗原經口侵入宿主免疫系統的載體.有效激發宿主抗詼種異源抗說局部和全身性的免疫應答，并已應用于細曲、病誨、寄生蟲等疫苗的研制“近年來，應用各種基因工程方法構建沙門萌成莎株、研究毒力基因的功能和表達調控、利用減毒&作為活栽體表達外源抗原以及研制口眼多價疫苗等已成為該領域的研究熱點。I減者St活載體口服疫苗的優點門服疫苗與傳統的注射接種疫苗相比其有許多優點：模仿自然感染途徑，保證大部分孫膜表面區域接觸疫苗,開發了由sigA介學的第一道防線；高效,既能引起黏膜免疫反應.也能引起系統免疫反應避免注射引起的疼痛和不適.也可避免使用針頭和針筒，減

13、少了污染的可能性；可覆盅大量人群，特別詁合年長者和嬰兒，因為黏膜免疫不受與年齡相關的機能障礙的影響，而嬰兒黏膜免疫系統的發育耍早于全身免疫；另外口服疫苗還有可能用于防治自身免疫反應和過敏反應,使用更方便?；罴毦d體疫苗是目前疫苗研制的重要方向，活菌栽體疫苗向機體遞送疫苗抗原.使抗原物質對黏膜的免疫剌激作用更接近于病原體的自然感染途徑.不僅可有效地剌激腸道產生局部免疫應答，而旦可誘導機體產生特異性系統免疫反應，使機體獲得全面的保護力.St作為疫苗載體只有以下優點：（1可以口服，易于大規模免疫接種；（2）因侵入淋巴系統，能更有效地激發宿主的體液和細胞免疫；（3）具有免疫佐劑的作用；（4）免疫具有持

14、續性，能夠定居在宿主小腸和腸相關淋巴組織，不致羯，并且能穩定表達外源基因；（5）單次接種即可誘導機體產生全面的細胞免疫、體液免疫和愁膜免投應答；（6）所表達的靶抗原不需純化，4直接用于免疫保護試驗，免去r蛋白質后姓理的復雜工序；（7）價格低廉；（8）易于生產、儲存和運輸.2 Si菌株的特征及免疫機制St菌株的特征St是一種細胞內寄生曲，主要寄生于抗原提呈細胞中.革蘭陰性，兩端飩圓，大小寬為0.6-2.0Fm.長1.04.0m,有菌毛。通常具有周身靴毛.-般無英膜.能運動.兼性厭氧.最適培芥溫度為37-C.營養要求不高，在普通瓊脂培養基fl訶生長.在SS選擇鑒別培養基上形成中等大小、無色半透明的

15、S型菌落。2.1 St的入侵機制St主要通過以下方式在機體內侵染和擴散毒素依賴型沙門前可分泌一種蛋白毒索.使分散在腸上皮細胞的M細胞的細胞膜和骨架變形.沙門痢得以經M細胞穿過上皮細胞屏障進入集合淋巴結小結中，被分布在此的抗原提呈細胞（APC）捕獲攜帶至周圍淋巴組織；（2）非毒索依賴型沙門菌能被腸黏膜中表達CD18的吞噬細胞吸收.經血流進入脾臟，誘發機體的系統免疫應答；（3）樹突狀細胞（DC）可以破壞腸上皮細胞屏障，以樹狀突起捕獲作毒素依賴型沙門曲，使其穿過腸上皮細胞.攜帶沙門帶的DC可以從腸內皮細胞遷至腸系膜淋巴結。小鼠模型研究證實，小鼠口服減毒沙門菌后.數分鐘內即可在血液中檢出帶有減毒沙門萌

16、的單核-巨噬細胞.在淋巴結、脾臟和集合淋巴結小結內都可檢出沙門菌的存在.2.2 St的免疫應答St通過M細胞進入黏膜下淋巴組織后可激活Th2細胞產生大屆的白細胞介索艾，它能活化B細胞，并使之分化為漿細胞，在產生Ig的過程中發生向IgA的類型轉換。腸黏膜上皮細胞還能產生分泌小體與雙體【gA分子結合，形成分泌型IgA分泌到腸黏膜表而，slgA能抵抗腸道蚩白酣的分解作用，形成黏膜上的局部抗體在黏膜免疫中起重要作用.固有層CD4'T細胞受到細用抗原物質的激活，能產生干擾素增強單核巨噬細胞的吞咚作用，從而殺滅細胞內的寄生物，起到細胞免疫作用。一般減毒St仍有良好的侵襲力，因此它進入機體的方法與野

17、毒株相似，都是穿過M細胞進入機體.但M毒后毒力明顯下降，對M細胞的細胞毒作用可能沒右或很小.具有侵襲力的沙門菌m選擇性地入侵派氏集合淋巴結的M細胞并破壞M細胞，然后被位于上皮下容隆區的APC捕獲，之后APC再與相關免疫細胞相互作用.從而產生局部帖膜免疫、體液免疫以及細胞免疫應答。3 St減毒株的構建及其口服疫苗的應用研究RalE突變株及其疫苗應用減毒傷寒沙門lWTy21a是Germanier于1975年用化學誘變劑亞硝基弧誘變及紫外線照射誘導非定點突變Ty2株得到的.Ty21a株已有商品化生產，并已獲準用于人體,Ty2】a具有galE突變，不能合成Vi英膜抗原.galE編碼UDP半乳糖4異構解

18、，缺失后不能完成UDP半乳慵與IJDP箭匐糖的互換，而半乳摭殘基是野生型傷寒桿館光滑型LPS?？乖母煞?Ty21a在無半乳精條件下為粗槌型無免疫原性.Ty21a是一種很有用的典型活鑿苗，但它免疫后僅提供中等程度的保護作用，疫苗接種后3年人群保護率可達67%,5年后疫苗的保護率為62%.旦接種者對曲茴配方及攝入劑依過于敏感.用化學誘變的方法產生突變株具有很大的有H性，除造成galE基因缺損外，還將造成其他已知的和未知的基因缺損.因而在疫苗的制備過程中，質估很難控制。Fraillcry等研究表明,Ty2U可用作外源基因表達的很好載體，在誘導抗傷寒沙門曲抗體的同時，能產生針對人乳頭痛病毒16型

19、的部分保護.3.1 ar?；蛉笔е昙捌湟呙?應用aroA基因編碼5-烯隙丙閉酰莽草恢3-磷酸合成酸催化的是合成對氨基苯甲酸和2,3-二須基革的中間反應.1981年,Hioseth等用TnlO轉座子隨機插入法插入到aroA基因中.構建了aroA基因缺陷的減毒的StSL3261和SL3235。Ashby鏟以2X10%fu重組菌SL3261表達破傷風毒素C片段（TetC）,通過流胃途徑免疫新西蘭兔，免疫后4周發現該萌苗能誘導免產生較高滴度的血清抗TetC抗體.研究表明.以SL3261為載體表達的外源抗原經口服免疫新西蘭兔其有良好的免疫原性。雖然該突變株在哺乳動物體內幾乎不能得到這些化合物，但并不影

20、響營并缺陷株的感染性，且有很好的免疫原性。然而，當aroA突變株得到野生型細菌D、A時，存在毒力回復突變的可能性?；诎踩紤]，研究者們引入了2個戒3個特定突變的沙門菌疫苗株，如aroA/waaN突變株、aroA/aroD突變株（GID10KG1D105和G】D509）、aroC/aroD雙缺失株（CVD906和CVD908）、htrA/aroA突變株、aroC/aroD/htrA缺失株等.Xu等以減毒StaroA缺失株SL7207為載體表達幽門螺桿H.pylori）尿素酬B亞單位.口服免疫小械，并于免疫后4周進行攻擊實驗.發現該疫苗叮有效保護小鼠免受H.pylori的攻擊。Woo等以成毒St

21、aroA缺失株SL7207為載體表達HBsAg.以6X10%fu劑量口服免疫小鼠.研究表明，與DNA疫苗免疫相比，活前疫苗能誘導更強的CTL反應.3.2 cya/crp缺失株及其疫苗應用cya和erp是研究非常深入的沙門菌毒力調節基因.cya編碼環化腺昔酸合成酬和erp編碼cAMP受體蛋白在轉錄水平上調廿多種基因的表達，在運輸雙糖和氮基酸及合成纖毛、倒毛、鞭毛和至少一種外膜蛋白的過程中發揮政要作用.1987年.Curtiss和Kdly,l構建了St的cya和erp缺失的突變株"062、乂4064、乂4989及X499O等，研究證明，口服此減毒株具有高度免疫原性且高度減推。cya和er

22、p基因在染色體上相距IImin,二者同時回復突變的可能性比較小.asd基因編碼天冬氨酸0半乳糖脫冬酶催化的反應是細藺合成二氛基度二酸的中間步驟，DAP的缺失使革蘭陰性菌不能形成完好的細胞壁，最終死亡如asd/cya/crp缺失突變株x4072等.徐引弟等!利用我國廣泛使用的豬霍亂化學致弱毒株C500.構建了erp/asd雙突變株，即宿主栽體平衡致死系統.毒力降低，但對免疫原性影響不大，可高效表達外源基因。將來源于鼠傷寒的P22轉導雞沙門菌構建erp基因缺失株.導致鳴沙門前完全減毒口服免疫10d后能完全保護野毒株的攻擊，所有生化影響除毒力外可以由來自鼠傷寒攜帶crp基因的質粒pSDl10互補，c

23、rp缺失毒株nJ能成為針對將傷寒的候選疫苗Nayak等口"將含PspA基因的pJD4347與pYA3148重組得pYA3】93,轉染St減帝株X4550,構建rSt-PspA疫苗x4550(pYA3193),將109cfu疫苗口服免疫BALB/c和CBA/N鼠2次或用10,0cfu疫苗口服免疫新西蘭兔2次，末次免疫后4周用WU2有毒抹樸脈注射進行攻擊，發現免疫鼠血清IgGJgM和IgA增加，陰道沖洗液】gG和IgA升高，免疫兔血清和陰道沖洗液IgG增加，HALB/c鼠用3XlOfu有毒株攻擊后,66%(23/35)免疫成存活，BALB/c免疫鼠血清被動轉移給CBA/N鼠，可抵抗l(T

24、cfu錚脈注射或10'cfu腹腔注射的有毒株攻擊。3.3 Dam和phoP/phoQ缺失株及其疫苗應用沙門演的Dam基因編碼DNA腺昔酸甲基化酰至少調節由PhoP激活的40種基因的表達，而PhoP/PhoQ基因編碼轉錄激活因子/傳感器激酶。如Dam/PhoP/PhoQ三突變株ZJ】11、伴調節基因phopc基因缺失的營養缺陷型突變株乂4632等.Heithoff等"s發現.dam基因突變的St完全能在小仗的PP和小腸荔膜定居增殖至少5d,從而引起免疫反應，同時對深層組織定居有嚴就缺陷，對小鼠高度減毒.1989年.Miller等'構建了PhoP/PhoQ聯合突變的St液

25、毒株。PhoP突變會削弱細苗在巨噬細胞內的存活能力，它調節的是編碼細菌在巨嚏細胞中存活所必需的一種分泌蛋白或包膜蛋白的基因。研究證明該減毒株安全性較好口能產生良好的免疫反應。Angelakopoulos和Hohmann'”，以StphoP/phoQ/purB缺失株ATCC14028為載體表達H.pylori麻酶抗原，并首次在志嗥者身上進行了測試。研究表明，單劑曜口服免疫58X10，cfu疫苗的具有較好的安全性，且與堿褊St相比，M毒St能誘導更強的針對外源抗原的免疫應答。3.5其他減毒株及其疫苗應用隨著對越來越多的沙門菌的全基因組的認識，越來越多的基因用于沙門菌的基因工程減毒。3. 5

26、.1cIpXP和Ion缺失突變株St中ATP依賴的ClpXP蠱白酶能調控鞭毛的合成，缺失clpP基因的細菌呈現多鞭毛表型.如&ClpXP缺失突變株CS2007.Lon蛋白醒具有能降解抑制細胞分裂的SulA蛋白的能力，旦負調控具有侵襲性上皮細胞的侵襲力和侵襲基因的表達,缺失Lon基因的菌株呈現長纖毛表梨.如SiLon缺失突變林CS2022.以5X108efu劑*的CS2OO7和CS2022突變株口服接種BALB/c小鼠，免疫后4周抗LPS-IgG和sigA顯著升高。攻擊實驗表明.CS2OO7和CS2022缺失突變株能有效保護小鼠免受有毒株計456的攻擊ompR突變株ompR編碼外膜蚩白R

27、.ompR操縱子調控編研主要外膜蛋白ompC和。mpF的表達。用p22轉座突變StSIJ344主要外膜蛋白ompC、omp【)、ompF和ompR,ompC或ompF突變株毒力與SL1344相同，ompD突變株毒力稍微降低.ompR突變株經口服或靜脈免疫小鼠后表明已減毒.LD50降低10氣能很好地保護機體免受SL1344的攻擊吧3.5.2 poxA突變株poxA編碼丙眼酸氧化再，Kaniga首次報道了poxA突變對細菌毒力有影響.poxA突變株表現為多效應表型.SiUK21的poxA突變株口服小鼠毒力比UK21減低10,倍，靜脈接種減低IO,倍，但仍能在脾、腸系膜淋巴結和派氏集合淋巴結中定居，

28、能誘導強烈的體液免疫反應.能對致死故的野毒攻擊提供保護以°)pabA和pabB突變株:Zekarias等'小以液毒Stx8914為載體表達產氣英膜桿薄C末端a毒素，口股免疫后，發現詼疫苗偏能誘導雞產生抗壞死性腸炎的保護性反應。日前以誠毒St為載體的3種口眼活菌疫苗正處F臨床試驗階段：Ty2株的phoP/phoQ缺失突變株Ty800減毒單劑M口服活菌疫苗經J期臨床實毀表明，該疫苗能刺激機體產生強的IgA和血清?？贵w反應jaroC/aroD/htrA的缺失突變株CVF>908-htrA活減譜口服疫苗已成功通過U期臨床實臉，旦該菌株的V衍生萌株CVD909能持續表達Vi抗原，

29、目前已完成I期臨床實教)；Ty2株的cya/erp/edt缺失突變株沼073找毒單劑充口服活菌疫苗能同時表達ETEC抗原和抵抗ETEC的感染。I期臨床實驗表明，該疫苗具有較好的安全性和免疫原性可。4結語歌組找毒St口服疫苗作為一種新型疫苗,具有廣闊的應用前景。隨著現代生物學和DNA重組技術的發展以及對沙門菌毒力遺傳學的深入研究，在該病原體基因組中引入多重、限定、減毒和不能回復的突變已具備了可能性，這種突變是制備活M毒1服疫苗的遺傳學基礎。雖然減雁St活栽體疫苗有諸多優點，但.仍存在一些不足。制備疫苗使用的筋株盡管基減毒株.可能仍存在微弱的致病性，旦對革蘭陰性菌而言還要考慮LPS的虐性效應表達產

30、物與天然蛋白存在差異，表達產物可能對疫苗有害，表達蛋白水平校低；質粒DNA與宿七基因組整合的潛在危險性。此外，為達到更好的黏膜免疫效果，使口服疫苗得到更廣泛的應用，有關抗原提呈系統的改進、安全的黏膜佐劑的使用以及對體液免疫和細胞免疫的精確評價等方面仍需進行深入的研究相信隨君這些問題的闡明，以減毒St為載體的口眼疫苗的應用將日益廣泛.參考文獻1JVazquezTA.FangFC.Cellularroutesofinvasionbyen-teropathogensfj.CurrentOpinion,2000.3(1)：54-59.2 RedcignoM,UrbanoM,VaJzasinaB,eta

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