1、精選優質文檔-傾情為你奉上細胞融合的原理與技術摘要：細胞工程是生物工程主要組成之一，出現于20世紀70年代末至80年代初，是在細胞水平上改變細胞的遺傳特性或通過大規模細胞培養以獲得人們所需物質的技術過程。隨著細胞融合技術的不斷改進和完善，動物、植物及微生物細胞融合技術無論在基礎理論研究還是在實際應用中產生的影響將日益顯著。1.細胞融合原理細胞融合技術是20世紀60年代迅速發展起來的一項新興細胞工程技術。細胞融合(cell fusion)也稱細胞雜交( cellhybridization) 、原生質體融合(protoplast fusion)或體細胞雜交(somatic hybridizatio

2、n), 是指細胞通過介導和培養, 在離體條件下用人工方法將不同種的細胞通過無性方式融合( 合并) 成一個核或多核的雜合細胞的過程。體細胞融合后可形成四倍體或多倍體細胞，由此形成的雜交細胞，其特性會有很大的變化。細胞融合大體分三個階段進行。第一階段是制出細胞融合體。首先要用氧把細胞分散開，再把細胞壁溶解掉，這時的細胞就成了原生質體。原生質體用聚乙烯乙二醇(PEG)處理后，再把PEG洗掉，形成原生質體的結合。第二階段是融合子的鑒定。利用利于融合子生存的培養基刪選出已經融合的雜種細胞。第三階段是培養融合細胞階段。融合細胞在細菌培養基或是不含有細菌的液體培養基中進行培養，結合細胞反復分裂后，形成細胞團

3、，把細胞團移植于含有植物激素的培養基里長出莖、葉，再把它們移植于土壤之中或嫁接于植物體上，繼續生長形成新植物。1.1動物細胞融合一些致癌病毒雖然能夠誘導細胞融合,但由于具有毒性大等潛在的危險性而在應用上受到很大的限制,由此科研人員又試圖嘗試使用滅活的病毒來作為促融物,并且以異種細胞作為融合對象。1965年,英國Harris等報告滅活病毒可以用來融合不同種動物的細胞,并且指出由此產生的雜交細胞可以存活。當時世界上許多報刊很快就對這一發現在生物學上的重要性做出了評價,認為這是在細胞融合研究中的又一次突破。他們的貢獻在于證明了滅活的病毒可以作為一般方法用來在一定的條件下融合動物細胞,而且差異很大的動

4、物種之間的細胞可以被誘導融合,融合的細胞可以存活。1967年Weise和Green發現在人和鼠的融合細胞中,人的染色體優先丟失,并證明利用這一特點有可能對人染色體上的基因進行定位。1970年Ladda又進一步發展了去核的小鼠成纖維細胞進行融合實驗,開始了各種細胞重組的研究工作。從發現病毒能夠誘導細胞融合之后,動物細胞融合的研究工作迅速發展起來。然而,由于HVJ誘導細胞融合存在著病毒制備困難、操作復雜、滅活病毒的效價差異大等原因,人們一直試圖發現一種替代物作介質誘導細胞融合。1.2植物細胞融合植物細胞融合技術的發展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸鈉處理原生質體使之凝集

5、、融合。但那時還不能用酶法大量制備原生質體,使實驗受到原生質體數量的限制,因此植物細胞融合的起步比動物細胞融合要遲十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制備有活力的原生質體獲得成功,才使植物原生質體的融合工作迅速發展起來。1972年美國科學家Carlson等將粉藍煙草和郎氏煙草兩個異種的體細胞融合成功。20世紀70年代,細胞融合的研究范圍又擴展到植物間、動物間、動植物間、甚至人體細胞與動植物細胞之間。1.3微生物細胞融合1975年原生質體融合技術已擴展運用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先報道PEG促使真菌融合,以后的成功報道涉及酵母、霉菌、細菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬

6、間,使細胞融合技術繼動、植物之后,在微生物中也形成了實驗體系。2.細胞融合技術細胞融合技術作為細胞工程的核心基礎技術之一,已在農業、醫藥、環保等領域取得了開創性的研究成果,而且應用領域不斷擴大。細胞融合技術不僅為核質關系、基因調控、遺傳互補、細胞免疫學、腫瘤發生、基因定位、衰老控制等理論領域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應用于免疫學、遺傳學、發生生物學,特別是在單克隆抗體及動植物遠緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。細胞融合技術大體上可分為化學誘導融合、生物誘導融合和物理誘導融合三類。2.1化學誘導融合2.1.1鹽類融合法此法是應用最早的誘導原生質體融合的方法。鹽類融合劑對原生質體的破壞小

7、。今后研究應提高其融合率 ,使其對液泡化發達的原生質體能夠誘發融合。 2.1.2高鈣和高 pH值融合法Keller首先發現高 Ca2 +和高 pH值可以誘發融合。Melchers用此法將煙草種內 2個光敏感突變體誘導融合成功并獲得 100余株體細胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。 2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)1974 年發現的高效融合劑聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質體之間都可以融合，融合率可達30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結合，導致細胞脫水而發生質膜結構的變化，從而引起細胞融合。為了發揮PEG 促進細

8、胞融合的效力，必須采用較高的濃度(40%50%，分子量為6000)，但PEG 在高濃度下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。影響原生質體融合的因素很多。特別是環境中的陽離子存在，融合時的pH 也對原生質體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助于融合。如有鈣離子存在時，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時，若pH 較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負電荷的PEG與細胞膜表面分子相互作用，使原生質體帶電，彼此易于附著發生凝集所致。PEG誘導細胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩定、使用方便等特點，在細胞融合領域取得了可喜的成績，

9、大量的研究仍采用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經驗性大等缺陷。2.2 物理誘導融合2.2.1細胞電融合技術細胞電融合是以脂質膜和脂質一蛋白質膜的電學性質為基礎的，以雙向電泳和電子擊穿細胞質膜的聯合作用為手段，和細胞電注射構成一對互補技術。在短時間強電場的作用下，細胞膜發生可逆性電擊穿(Reverisb leb reakdown)，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然后在數分鐘后恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導他們的膜相互融合，從而導致細胞融合。細胞融合分為兩步：第一步是建立細胞間接觸(cell-to-cell

10、contact) ； 第二步，接受區膜結構受擾動而紊亂，然后恢復并融合。根據其誘導細胞接觸的性質，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細胞電融合法是指在進行細胞電融合時，無法排除親本細胞的自體融合而只進行雙親本間的細胞雜交融合。主要原因是細胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細胞聚集。非特異性電融合技術包括細胞物理聚集電融合法和細胞化學聚集電融合法。細胞融合所必需的兩個步驟為：細胞間接觸；接觸區的膜結構受到瞬間擾動而導致融合。只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細胞融合。與使用PEG的化學法相比，電融合誘導法是一種非常高效的細胞融合方法。電融合技術的優點在于：融合頻率高，是PEG的1

11、00倍；操作簡便、快速；對細胞無毒；可在鏡下觀察融合過程。故這種方法得以在短期內被廣泛采用，成為細胞融合的主要技術手段。該方法的缺點是必須購置專用的細胞電融合設備。2.2.2 激光誘導法激光誘導細胞融合術是利用激光微束對相鄰細胞接觸區的細胞膜進行破壞(或擾動)，可將兩個不同特性、不同大小的細胞在顯微鏡下實現融合。即利用光鑷捕捉并拖動一個細胞使之靠近另一個細胞并緊密接觸，然后對接觸處進行脈沖激光束處理，使質膜發生光擊穿，產生微米級的微孔。這樣，由于質膜上微孔的可逆性，細胞開始變形融合，最終成為一個細胞。使用此技術時， 使細胞接觸的方法可用光俘虜法；用低濃度的融合劑PEG (5% )使細胞聚法。目

12、前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細胞間接觸，即光鑷(potical tweezers)利用激光高斯光束光場的梯度力把細胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時，指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力，該梯度力把細胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實現對細胞的操作。激光微束融合法與病毒法、PEG法、電融合法相比較，可選擇任意兩個細胞進行融合，易于實現特異性細胞融合，作用于細胞的應力小，定時、定位性強，損傷小，參數易于控制，操作方便，可利用監控器清晰地觀察整個融合過程，實驗重復性好，無菌，無毒性。但它只能逐一處理細胞，不能像其他方法一樣同時處理大量細胞。而且由于其所需設備

13、昂貴復雜，操作技術難度大，很難推廣應用。在微生物原生質體融合中應用激光微束技，融合效率較低且喪失了高度選擇性的優點有賴后續步驟檢出融合子激光誘導融合技術仍處在發展初期，還有待進一步完善。2.3生物誘導融合(仙臺病毒(HvJ)誘導法)1962年日本的岡田善雄(Okada)偶然發現了由日本血凝性病毒(HVJ)或稱仙臺病毒引起的艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞的現象。岡田善雄的研究為人工誘導體細胞雜交奠定了方法學基礎。細胞融合現象的發現引起細胞學界的高度重。1965年英國的Harris和Watkins在利用滅活病毒誘導細胞融合方面做了大量的工作，并進一步利用這種滅活病毒來誘導不同種動物細胞間的融合。自從

14、發現活病毒可在體內介導癌細胞融合后，人們又實現了滅活病毒促進動物異種細胞的融合，從而打破了細胞融合的種屬屏障，推動細胞融合技術躍上新的臺階。但是，利用滅活的病毒誘導細胞融合，存在著許多問題，如病毒制備困難、操作復雜、滅活病毒的效價差異大、實驗的重復性差、融合率很低等。目前，這種方法主要適用于動物細胞融合，用于實驗室研究。2.4新細胞融合技術2.4.1離子束細胞融合技術雷電、輻射等自然過程中產生的低能離子可作用于生物體，20世紀80 年代中期，中國科學院等離子體物理研究所余增亮等人發現并證實了離子注入生物效應和粒子沉積生物效應的存在，建立了質量、能量、電荷三因子作用機制體系。在離子束與生物體相互

15、作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導致細胞表面被刻蝕，引起細胞膜透性和跨膜電場的改變，據此原理，發展了離子束誘導細胞融合技術。由于用于輻照的離子束的參數除了能量可調外，離子種類、電荷、質量皆可調，因此，離子束的可操縱性高，可以用微束對細胞進行超微加工，有目的地切割染色體用于基因工程和細胞工程，通過消除部分染色體或染色體的某些片段達到細胞非對稱融合的目的。此項研究一旦成功，將改變傳統的一對一細胞融合的弊端，減少供體細胞導入的染色體范圍，使融合更具目的性，大大減少篩選的工作量，將是細胞融合研究的一大進步。2.4.2空間細胞融合技術植物細胞融合過程中由于地面上地球重力的存在，有液泡的原生質體

16、與無液泡的原生質體的密度差加大，異源細胞融合得率十分有限。在利用動物細胞融合生產單克隆抗體過程中，在地面上由于無法排除地球重力的影響，要提高B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合得率相當困難。空間站微重力環境沒有重力沉降、熱對流和靜水壓等特點，不僅是研究重力生物學問題的理想場所，而且也為那些在地面因重力限制而難以發展的生物技術提供了新的機遇。20世紀80年代以來，德國細胞電融合技術發明家Zimmermann等人在空間材料科學的啟發下，試圖利用空間微重力條件改進細胞融合技術。大量的飛行實驗結果表明，在微重力條件下酵母細胞雜種得率有很大的增加。融合得率增加顯然是由于沒有重力沉降影響的緣故，雜種細胞活力增加可

17、能是細胞排列時間縮短引起的。最近的飛行試驗結果表明在微重力條件下，哺乳動物細胞融合得率增加10倍，有活力的雜種細胞數比地面對照增加2倍。植物有無液泡原生質體的電融合得率，在微重力條件下比地面增加10-15倍。在取得這些成功實驗的基礎上，進一步研究融合后的細胞在空間培養的可能性已經開始。2.4.3非對稱細胞融合技術即利用某種外界因素(常為射線，即融合，gamma-fusion) 輻照某一細胞原生質體，選擇性地破壞其細胞核。并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6 G處理在細胞核中含有優良基因的第二種原生質體，選擇性地使其細胞質失活。然后融合來自這兩個原生質體品系的細胞，從而實現所需胞質和細胞核基因的優化組合，或

18、使前者被打碎的細胞核染色體片段中的個別基因滲入到后者原生質體的染色體內，實現有限基因的轉移，從而在保留親本之一全部優良性狀的同時改良其某個不良性狀。實踐表明非對稱細胞融合技術通過射線和X射線等照射，為實現供體親本少數基因的轉移，創造種間、屬間雜種提供了可能性。值得注意的是，此方法特別適用于細胞質雄性不育基因的轉移，通過輻照胞質不育的原生質體，破壞其染色體，與其具有優良性狀品種的原生質體融合，從而獲得實用的新的胞質不育系。這些都是常規育種所做不到的。2.4.4高通量細胞融合芯片高通量細胞融合芯片利用微電極陣列在微米范圍內(1040m)產生的高強度、高梯度輻射電場，使得細胞在特殊輻射電場的作用下產

19、生介電質電泳力，精確處理和刺激預定的目標細胞，從而使目標細胞按照預先設計的方向(可以是任何預先設計好的方向)以預定的速度(可以是不同種的細胞以不同的速度定向)移動，從而按照設計要求準確地、大批量地得到目標細胞配型，集成微電極陣列的微流控系統，可以方便靈活地實現對細胞的操作、隔離和轉移由于在微通道內微電極間距可以做得很小，因此獲得同樣強度的輻射電場強度只需施加較低電壓的交變電場和脈沖即可，不用加載昂貴的高電壓發生裝置。高通量細胞融合芯片可以與化學誘導融合、電誘導融合等方法相互結合，比如：在細胞融合緩沖液中加入少量的PEG可大大提高細胞的融合率此外，二價陽離子(例如：鈣離子)以及蛋白酶對細胞進行預

20、處理，融合率也可大幅提高。2.4.5基于微流控芯片的細胞融合技術隨著微機電系統(MEMS)技術和微加工技術的發展。微電極陣列的設計加工制作也日趨成熟，加之微通道網絡可以整合到生物芯片之上，這將使得微流控系統成為細胞融合的理想平臺，利用微流控系統可以按照預定的要求大量融合異種細胞。目前，基于微流控芯片的細胞融合技術已成為細胞融合技術研究的重點領域。利用基于芯片技術的微流控系統不僅可以實現對細胞甚至單個細胞的操控，比如轉移、定位、變形等，也可以同時輸送、合并、分離和分選大量細胞，細胞融合在芯片上可以通過并行或快速排隊的方式實現此外由于在微通道內的腔體容積很小，所以會大幅減少細胞融合中所需的細胞數量，同時細胞融合率和雜合細胞的成活率會大大提高。3.細胞融合技術的應用及發展前景縱觀細胞融合技術的發展歷史，細胞融合技術的不斷改進一方面表現在融合劑上，另一方面體現在新方法上，再者體現在融合對象的不斷擴展上。融合劑走過了從活病毒，滅活病毒生物階段到PEG化學物質階段；新方法不斷涌現，從生物學，化學方法，物理學方法過渡到各種方法的綜合應用乃至應用空間技術。