1、LOGO1中國藥典中國藥典無菌及微生物無菌及微生物限度檢查法發展與修訂限度檢查法發展與修訂重慶市食品藥品檢驗所 2醫藥產品的發展與挑戰醫藥產品的發展與挑戰v 醫藥產品的發明與發展進步極大地改變了人類的命運醫藥產品的發明與發展進步極大地改變了人類的命運v 獨具特色的中藥注射液獨具特色的中藥注射液v 特殊的醫藥環境使我國成為規模龐大的特殊的醫藥環境使我國成為規模龐大的“吊瓶大國吊瓶大國”v 注射用藥品成為注射用藥品成為“高風險產品高風險產品”3醫藥產品的發展與挑戰醫藥產品的發展與挑戰v微生物控制及檢驗成為高難度工作微生物控制及檢驗成為高難度工作 一百多年來人們努力提高在一百多年來人們努力提高在“有

2、菌的環境有菌的環境”生產生產“無菌的產品無菌的產品”的能力，事實證明這一努的能力，事實證明這一努力至今充滿挑戰。力至今充滿挑戰。 20062006年年7 78 8月發生了震驚月發生了震驚 全國的全國的“欣弗事件欣弗事件” 直接死亡直接死亡1111人人 企業倒閉企業倒閉 至今余震不斷至今余震不斷4醫藥產品的發展與挑戰醫藥產品的發展與挑戰v “欣弗事件欣弗事件”對我國的藥品生產監管產生了深遠的影響，對我國的藥品生產監管產生了深遠的影響，直接推動了新的藥典方案和新版直接推動了新的藥典方案和新版GMPGMP規定的出臺。規定的出臺。 “欣弗事件欣弗事件”將永遠成為無菌藥品生產典型反面教材將永遠成為無菌藥

3、品生產典型反面教材 有人借此詆毀中國醫藥產品是在廁所生產的，理由是從未開封的欣弗中分離出了污水常見菌肺炎克雷伯菌 顯微圖顯微圖像像單菌落單菌落5醫藥產品的發展與挑戰醫藥產品的發展與挑戰v20122012年年1010月，美國新英格蘭合成制藥中心月，美國新英格蘭合成制藥中心生產的注射用類固醇霉菌污染，造成數百生產的注射用類固醇霉菌污染，造成數百人感染真菌腦炎，至年底統計死亡人感染真菌腦炎，至年底統計死亡3939人。人。 v在50支密封藥瓶中檢測出曲霉菌和突臍乳孢菌兩種類型 6藥品微生物污染的反思藥品微生物污染的反思v在醫藥產品的發展過程中，盡管世界在醫藥產品的發展過程中，盡管世界各國付出過慘重代價

4、，實際上稍有不各國付出過慘重代價，實際上稍有不慎悲劇仍然可能重演。慎悲劇仍然可能重演。 悲劇的避免悲劇的避免! 尊重規律，科學監管，全程無縫監控，嚴格落實各項管理、驗證、檢查和分析調查措施，切實降低無菌藥品的微生物污染風險。7歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展v 74年、年、84年、年、90年衛生部年衛生部藥品衛生學檢查法藥品衛生學檢查法；86年衛生部頒年衛生部頒布布藥品衛生標準藥品衛生標準v 1995年版藥典首次收載微生物限度檢查法年版藥典首次收載微生物限度檢查法v 2000年版藥典首次收載微生物限度標準年版藥典首次收載微生物限度標準v 2005版版 將按劑

5、型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度將按劑型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度 首次收載方法驗證要求首次收載方法驗證要求 無菌檢查培養時間與國外接軌無菌檢查培養時間與國外接軌v 2010版版 首次收載培養基適用性檢查要求首次收載培養基適用性檢查要求 強調對微生物檢驗過程的驗證及過程控制強調對微生物檢驗過程的驗證及過程控制 部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論8中國藥典中國藥典2010年版的框架組成年版的框架組成v無菌檢查法無菌檢查法v微生物限度檢查法微生物限度檢查法v滅菌法滅菌法 抑菌效力檢查法指導原則 藥品微生物檢驗替代方法驗證

6、指導原則 藥品微生物限度檢查法應用指導原則 藥品微生物實驗室規范指導原則9修訂背景修訂背景v歐、美、日等主要藥典均收載了協調一致歐、美、日等主要藥典均收載了協調一致的微生物檢查法和限度標準，由于歷史原的微生物檢查法和限度標準，由于歷史原因，我國目前的微生物限度檢查體系與國因，我國目前的微生物限度檢查體系與國際相比存在差距，這一差距對于目前我國際相比存在差距，這一差距對于目前我國企業產品出口造成很大的障礙，也對我國企業產品出口造成很大的障礙，也對我國的微生物質量控制造成很大困惑。的微生物質量控制造成很大困惑。10修訂背景修訂背景v雖然中國目前不是雖然中國目前不是ICH的成員國，而的成員國，而是以

7、觀察員的身份進入，但中國與國是以觀察員的身份進入，但中國與國外制藥行業交往日益增多，中國藥品外制藥行業交往日益增多，中國藥品要想進入國際市場，藥品的檢驗方法要想進入國際市場，藥品的檢驗方法和標準與和標準與ICH保持一致，勢在必行。保持一致，勢在必行。 112015版藥典修訂的具體原則版藥典修訂的具體原則v檢驗方法與國外藥典進一步協調；檢驗方法與國外藥典進一步協調；v已有的指導原則實用化，通過科研解決指導原則已有的指導原則實用化，通過科研解決指導原則實用化問題；實用化問題；v增加新的指導原則，特別是對與企業過程控制相增加新的指導原則，特別是對與企業過程控制相關的指導原則。關的指導原則。12201

8、5版藥典無菌及微生物限度檢查法目標版藥典無菌及微生物限度檢查法目標v建立統一的質量技術要求，保持各方藥典科技建立統一的質量技術要求，保持各方藥典科技水平一致，保證用藥安全、有效。水平一致，保證用藥安全、有效。 質量控制、檢驗技術、檢驗標準等v減少國際貿易的障礙。減少國際貿易的障礙。v統一醫藥產品進入國際市場的技術門檻，促進統一醫藥產品進入國際市場的技術門檻，促進國際間藥品在同一技術平臺的公平競爭。國際間藥品在同一技術平臺的公平競爭。 132015版藥典無菌及微生物限度檢查法版藥典無菌及微生物限度檢查法化學藥品與生物化學藥品與生物制品：制品：與協調案統一與國際先進水平同步發展具體目標具體目標中藥

9、：中藥： 加大科研投入，在方法上與協調案統一，在項目、限度等方面制定與中藥相適應的目標。 以我為主，引領國際發展。142015版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內容版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內容v修訂后的中國藥典微生物檢驗系統成為一個較修訂后的中國藥典微生物檢驗系統成為一個較完備的標準體系，將收載完備的標準體系，將收載15個左右的微生物檢個左右的微生物檢查法和指導原則。查法和指導原則。v 修訂后的中國藥典微生物檢測系統與國外完全修訂后的中國藥典微生物檢測系統與國外完全一致。一致。v對實驗環境進行了重大修訂。對實驗環境進行了重大修訂。15無菌檢查實驗室環境規定的修訂無菌檢查實驗室環境規定的修

10、訂 修訂依據及意義：修訂依據及意義： 2010年版年版GMP中附錄一中附錄一無菌藥品無菌藥品和附錄三和附錄三生物制生物制品品中均規定，非最終滅菌產品各工序關鍵操作環境應為中均規定，非最終滅菌產品各工序關鍵操作環境應為B級級背景下的背景下的A級；無菌檢查的潔凈環境不得低于生產關鍵區的潔級；無菌檢查的潔凈環境不得低于生產關鍵區的潔凈環境要求。凈環境要求。2010年版2015年版應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區域內或隔離系統進行應在潔凈度B級背景下的局部A級單向流空氣區域內或隔離系統中進行16無菌檢查法的培養基系統無菌檢查法的培養基系統培養體系的差異是導致中國藥典無菌檢查與國外

11、藥典無菌檢查的系統性差異，從而帶來結果之間的不確定性及不可比性。 這是我國藥典無菌檢查法必須關注的問題！ 藥典USP/EP/JP中國藥典2010及之前版本分類依據按營養和培養條件分按微生物類別分質控分類需氣、厭氣菌細菌、真菌檢驗體系與廣譜的培養條件對應人為地選擇培養評價嚴謹易誤導結果判斷或造成漏檢17無菌檢查培養基及其有關內容的修訂無菌檢查培養基及其有關內容的修訂v 無菌檢查是一個定性試驗，根據檢查方法，要求所用培養基具有廣無菌檢查是一個定性試驗，根據檢查方法，要求所用培養基具有廣譜的促菌生長能力，而不是也不可能一開始就對可能污染的微生物譜的促菌生長能力，而不是也不可能一開始就對可能污染的微生

12、物分類進行培養。為此，各國藥典無菌檢查用培養基都有一個不斷改分類進行培養。為此，各國藥典無菌檢查用培養基都有一個不斷改進至基本確定的發展過程。進至基本確定的發展過程。 1950年美國藥典第十六章已確定使用硫乙醇酸鹽流體培養基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養基(TSB) 現USP、BP、EP、JP及ICH均規定使用硫乙醇酸鹽流體培養基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養基(TSB) 但在我國長期的微生物分類培養觀念下，認為改良馬丁培養基(MM)更適用于真菌檢查。18v2011年藥典會微生物專業委員會立題對無年藥典會微生物專業委員會立題對無菌檢查用培養基進行了研究菌檢查用培養基進行了研究國產胰國產胰酪大豆

13、胨培養基和改良馬丁培養基的微生酪大豆胨培養基和改良馬丁培養基的微生物促生長能力考察物促生長能力考察 對國產的3個廠家的MM培養基和3 個廠家的TSB培養基與BD公司的TSB培養基進行了系統對比實驗。19實實 驗驗 菌菌 株株v細菌：細菌： 藤黃微球菌CMCC(B)28001 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501 克氏庫克菌（北京所參加國際微生物鑒定所得）v真菌：真菌： 黑曲霉CMCC(F)98003 臘葉芽枝霉CMCC(F)7702 一株從樣品或環境中分離的霉菌 207個實驗室的實驗結論個實驗室的實驗結論v經統計分析表明：國產胰酪大豆胨液體培養基經統計分析表明：國產胰酪大豆胨液體培養基(TSB

14、)和改良馬丁培養基和改良馬丁培養基(MM)的促菌生長能力無的促菌生長能力無顯著性差異。顯著性差異。v國產胰酪大豆胨液體培養基國產胰酪大豆胨液體培養基(TSB)和改良馬丁培和改良馬丁培養基養基(MM)適宜生長的微生物種群（廣譜性）無顯適宜生長的微生物種群（廣譜性）無顯著性差異。著性差異。v國產的兩種培養基不比國產的兩種培養基不比BD公司生產的胰酪大豆公司生產的胰酪大豆胨液體培養基胨液體培養基(TSB)質量差。質量差。212015版無菌檢驗用培養基的修訂版無菌檢驗用培養基的修訂2010年版2015年版硫乙醇酸鹽流體培養基3035；2025 （三部）改良馬丁培養基置2328 培養硫乙醇酸鹽流體培養基

15、3035；2025 （生物制品兩種溫度）胰酪大豆胨肉湯培養基（TSB)置2025 培養選擇性培養基0.5%葡萄糖肉湯培養基營養肉湯培養基營養瓊脂培養基改良馬丁瓊脂培養基選擇性培養基0.5%葡萄糖肉湯培養基胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）沙氏葡萄糖肉湯培養基沙氏葡萄糖瓊脂培養基222015版無菌檢查法修訂版無菌檢查法修訂v增訂了無菌檢查法所用培養基的性能定義增訂了無菌檢查法所用培養基的性能定義 “硫乙醇酸鹽流體培養基（FTG）是厭氧菌檢查的首選培養基，同時也可用于需氣菌檢查。” “胰酪大豆胨液體培養基（TSB）適用于真菌和需氣菌的檢查。”即某種污染了需氣菌的供試品，無論被接種在硫乙醇酸鹽流體培養基

16、（FTG）中還是被 接種在胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中均可被檢出。意義：糾正了微生物學檢查中長期存在的對微生物分類培養的概念，提高污染微生物的檢出率，與先進國家藥典保持一致。23根據培養基的調整所做的相關調整根據培養基的調整所做的相關調整培養基修訂培養基修訂培養基靈敏培養基靈敏度檢查及方度檢查及方法適用性試法適用性試驗中的修訂驗中的修訂菌液制備用培菌液制備用培養基的修訂養基的修訂硫乙醇酸鹽流體培養基：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（大腸埃希菌）、生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養基：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（大腸埃希菌）、生孢梭菌胰酪大豆胨液體培養基：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液

17、體培養基：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉24三部藥典無菌檢查方法的整合修訂三部藥典無菌檢查方法的整合修訂v整合中的焦點：整合中的焦點： 三部無菌檢查法中規定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養三部無菌檢查法中規定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養基必須分成雙份，分別置基必須分成雙份，分別置3035、2025 兩個溫度兩個溫度下培養。以致在下培養。以致在取樣量取樣量、檢驗量檢驗量、接種方式接種方式、培養溫培養溫度度、陽性對照試驗陽性對照試驗等方面存在與二部不一致的規定。等方面存在與二部不一致的規定。25國際上生物制品無菌檢查法的情況國際上生物制品無菌檢查法的情況v美國美國FDA（May2001）和歐盟（）和歐盟

18、（March1999）均早已接受藥典無菌檢查法適用于生物技術產均早已接受藥典無菌檢查法適用于生物技術產品及生物制品（見品及生物制品（見ICH Q6B生物技術產品生物技術產品/生物生物制品檢定規程及標準）。制品檢定規程及標準）。vUSP、EP、BP、JP及ICH的無菌檢查法中均沒有對生物制品作出特殊的規定。26v分歧出現在我國對分歧出現在我國對WHO 6號規程的引用號規程的引用上。從可以查到的上。從可以查到的中國生物制品規程中國生物制品規程1979年版開始，規定樣品接種硫乙醇酸鹽年版開始，規定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養基雙份置雙溫度下分別培養。流體培養基雙份置雙溫度下分別培養。v 這一規定一直被

19、延續到這一規定一直被延續到2010年版三部的年版三部的無菌檢查法，成為長達無菌檢查法，成為長達35年的我國生物制年的我國生物制品無菌檢查法的特殊規定。品無菌檢查法的特殊規定。 27整合調查整合調查v 據反映，歷史上個別地區在生物制品無菌檢查中曾經發據反映，歷史上個別地區在生物制品無菌檢查中曾經發現個別品種在現個別品種在2025 培養的硫乙醇酸鹽流體培養基中培養的硫乙醇酸鹽流體培養基中有菌生長的情況（但未作鑒定和溯源明確是什么菌）。有菌生長的情況（但未作鑒定和溯源明確是什么菌）。v 從微生物適宜培養條件分析從微生物適宜培養條件分析 嗜熱型需氧菌適宜生長溫度為4558； 嗜溫型需氧菌適宜生長溫度為

20、2044； 嗜冷型需氧菌適宜生長溫度為1018；疑點和疑問：疑點和疑問：陽性產品實驗操作中是否有確保無污染的證明？陽性產品實驗操作中是否有確保無污染的證明？是否存在未知的是否存在未知的厭氧菌厭氧菌必須在必須在2025 培養才能生長？培養才能生長？在胰酪大豆胨液體培養基在胰酪大豆胨液體培養基2025 下培養能不能被檢出？下培養能不能被檢出？28v修訂原則修訂原則 以國際發展趨勢為主導，遵照以國際發展趨勢為主導，遵照2015年版藥典編制大年版藥典編制大綱三部藥典必須整合的要求進行，以二部為基礎，在綱三部藥典必須整合的要求進行，以二部為基礎，在檢驗數量、檢驗量、陽性對照樣品量、陽性對照試驗檢驗數量、

21、檢驗量、陽性對照樣品量、陽性對照試驗方法、培養溫度等方面互相兼顧，作原則性要求而不方法、培養溫度等方面互相兼顧，作原則性要求而不作具體細則規定。作具體細則規定。 致力于今后逐步統一完善。致力于今后逐步統一完善。 29無菌檢查法其他主要的修訂無菌檢查法其他主要的修訂2010年版2015年版薄膜過濾法應優先采用封閉式薄薄膜過濾法應優先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般過濾器。膜過濾器，也可使用一般過濾器。薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。直接接種法即取規定量供試品分直接接種法即取規定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培

22、養基中養基和改良馬丁培養基中直接接種法適用于無法用薄膜過濾法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。進行無菌檢查的供試品。即取即取;除除生物制品外，一般樣品兩種培養基接生物制品外，一般樣品兩種培養基接種的支種的支/ /瓶數相等；生物制品硫乙醇酸瓶數相等；生物制品硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基接種的支基接種的支/ /瓶數為瓶數為2:12:1不能從外觀上判斷有無微生物生不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量接種至同長，可取該培養液適量接種至同種新鮮培養基中，種新鮮培養基中，細菌培養細菌培養2天、天、真菌培養真菌培養3天。天。不能從

23、外觀上判斷有無微生物生長，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量接種至同種新鮮培可取該培養液適量接種至同種新鮮培養基中，養基中，培養培養3天天。30312015年版中國藥典微生物限度檢查法修訂年版中國藥典微生物限度檢查法修訂非無菌藥品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度檢查：微生物計數法微生物計數法非無菌藥品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查法控制菌檢查法非無菌藥品微生物限度標準非無菌藥品微生物限度標準參照參照USP35版和版和版對版對微生物限度微生物限度檢查法檢查法收載形式收載形式進行了修訂，將進行了修訂，將其分為三個附錄：其分為三個附錄：32微生物限度檢查法實驗

24、環境的變化微生物限度檢查法實驗環境的變化2010年版2015年版應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區域內進行。應在受控潔凈環境下（不低于D級）的局部不低于B級單向流空氣區域內進行。總的原則：總的原則： 無外源性微生物污染樣品無外源性微生物污染樣品 樣品的微生物檢測環境不低于樣品的生產環境樣品的微生物檢測環境不低于樣品的生產環境33微生物限度檢查法技術方法適用范圍變化微生物限度檢查法技術方法適用范圍變化2010年版2015年版系檢查非滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數明確規定本檢查法不適用于活菌制劑的檢查明確規

25、定本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動化檢測方法，但必須證明其替代方法等效于藥典規定的檢查方法。嗜溫型微生物最適生長溫度為嗜溫型微生物最適生長溫度為20 44（ 2543）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為2834微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂v試劑和試藥試劑和試藥 中和劑、滅活劑和表面活性劑均應對微生物無毒性，其相互間具有相容性，有利于樣品中微生物均勻分布。 v稀釋液稀釋液 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液； pH7.2

26、無菌磷酸鹽緩沖液； 無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）； 無菌磷酸鹽緩沖液（結腸溶制劑）； 胰酪大豆胨液體培養基不限于上述稀釋液（如0.9%無菌氯化鈉溶液）35微生物限度檢查計數法微生物限度檢查計數法修訂前修訂前大腸埃希菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉試驗菌株試驗菌株修訂后修訂后銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉36微生物限度檢查計數法培養基和試驗菌的修訂微生物限度檢查計數法培養基和試驗菌的修訂2010年版2015年版營養瓊脂：營養瓊脂： 大腸埃希菌大腸埃希菌 金

27、黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌玫瑰紅鈉瓊脂：玫瑰紅鈉瓊脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉胰酪胨大豆瓊脂：胰酪胨大豆瓊脂： 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂：沙氏葡萄糖瓊脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉37微生物限度檢查計數法培養溫度和時間的修訂微生物限度檢查計數法培養溫度和時間的修訂2010年版2015年版細菌數 營養瓊脂 3035 3天 霉菌及酵母菌數 玫瑰紅鈉瓊脂 2328 5天需氧菌總數 胰酪胨大豆瓊脂 3035 35天霉菌及酵母菌數 沙氏葡萄糖瓊脂 20

28、25 57天38微生物限度檢查計數法接種方法的修訂微生物限度檢查計數法接種方法的修訂2010年版2015年版1、平皿傾注法2、薄膜過濾法1、平皿法（包括傾注法和涂布法），平皿法（包括傾注法和涂布法），明確可使用直徑較大的平皿，且培養基的用量應相應增加。2、薄膜過濾法薄膜過濾法3、最可能數最可能數（Most-Probable-Number,簡稱MPN）。MPN法用于微生物計數時精密度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品可能是更適合的方法。MPN法僅在供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法的情況下使用，且不適用于霉菌計數。39微生物限度檢查計數法方法的修訂微生物限度檢查計數法方法的修訂2010年版2

29、015年版術語變化術語變化：計數方法驗證細菌計數法細菌計數法用三種菌種進行驗證菌液加入方式菌液加入方式：平皿計數驗證時菌液和供試液同時加入平皿，加菌量10100cfu術語變化術語變化：計數方法適用性試驗總需氧菌計數法總需氧菌計數法用五種菌種試驗菌液加入方式菌液加入方式：菌液加入供試液中，使每ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu,且所加菌液的體積不超過供試液體積的1%。40適用性試驗加入方式舉例：適用性試驗加入方式舉例：各試驗組溶液各試驗組溶液分裝分裝5份份每份每份金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液白色念珠菌液白色念珠

30、菌液黑曲霉菌液黑曲霉菌液41微生物限度檢查計數法檢測項目及結果判斷的修訂微生物限度檢查計數法檢測項目及結果判斷的修訂2010年版2015年版細菌數細菌數營養瓊脂培養基霉菌和酵母菌數霉菌和酵母菌數玫瑰紅鈉瓊脂培養基酵母菌數酵母菌數酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基需氧菌總數需氧菌總數生長在胰酪胨大豆瓊脂培養基上所有菌落（包括霉菌和酵母菌）霉菌和酵母菌總數霉菌和酵母菌總數指生長在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上的所有菌落（包括細菌菌落數）。回收率回收率：70%以上回收率回收率：0.5-2（50%-200%）42微生物限度檢查計數法結果判斷有計數干擾情況時的修訂微生物限度檢查計數法結果判斷有計數干擾情況時的修訂20

31、10年版2015年版若營養瓊脂上生長霉菌與酵母菌、玫瑰紅鈉上生長細菌，則分別點計霉菌和酵母菌、細菌數。然后將營養瓊脂上霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉上細菌數與玫瑰紅鈉上霉菌和酵母菌數或營養瓊脂上細菌數進行比較，以菌落數高的培養基中菌數為計數結果。若因沙氏葡萄糖瓊脂上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂或選擇性培養基（如玫瑰紅鈉瓊脂）。43微生物限度檢查計數法結果判斷的修訂微生物限度檢查計數法結果判斷的修訂2010年版2015年版供試品的細菌數、霉菌數和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試

32、兩次，以三次結果的平均值報告菌數。無相關內容描述，因微生物試驗的特殊性，在實際操作過程中應依據附錄藥品微生物實驗室質量管理指導原則對實驗結果進行充分和全面的評價。44微生物限度檢查計數法結果判斷增訂內容微生物限度檢查計數法結果判斷增訂內容2010年版2015年版無各品種項下要求執行的微生物限度標準如下：101cfu 可接受的最大限度為20；102cfu 可接受的最大限度為200；103cfu 可接受的最大限度為2000；依次類推.若供試品的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的檢查結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。45微生物限度檢查

33、控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸埃希菌大腸菌群大腸菌群沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大腸埃希菌耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌46微生物限度檢查控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸菌群方法驗證用大腸埃大腸菌群方法驗證用大腸埃希菌進行驗證希菌進行驗證耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌用大腸耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌進行方埃希菌和銅綠假單胞菌進行方法適用性試驗法適用性試驗加菌量：加菌量：1010100cfu100cfu加菌量：不大于加菌量：不大

34、于100cfu100cfu47微生物限度檢查控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版傳統的鑒別試驗為主個體形態、菌體形態生理生化反應生態學特征血清學反應對噬菌體及抗生素的敏感性用傳統的鑒別試驗或采用其它適宜的方法進行鑒別分子生物學技術應用（溯源分析）482015版微生物限度標準的修訂版微生物限度標準的修訂將2010版中國藥典一、二、三部微生物限度標準項目進行對比、整合。采用一部的限度標準項目作為合并后限度標準的基礎。修訂思路修訂思路與美、歐、日藥與美、歐、日藥典比較，修訂中國典比較，修訂中國藥典的微生物限度藥典的微生物限度標準。標準。采用清晰直觀的表格形式，按給藥

35、途徑，分液體、固體性質，列出各類藥品的限度標準。49修訂后限度標準的總體結構及規定（共修訂后限度標準的總體結構及規定（共9項，項，4個表）個表）1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規定。、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規定。2、用于手術、燒傷或嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查規定、用于手術、燒傷或嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查規定3、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準（見表、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準（見表1）4、非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表、非無菌不含藥

36、材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表1）5、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表2）6、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表3）7、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表4）8、有兼用途徑的制劑應符合各給藥途徑的標準、有兼用途徑的制劑應符合各給藥途徑的標準9、霉變、長螨者以不合格論、霉變、長螨者以不合格論限限度度標標準準50v表表1、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準及非無菌不含藥材原粉的、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度

37、標準及非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準中藥制劑微生物限度標準v表表2、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準v表表3、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準v表表4、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準需氧微生物總數（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數（cfu/g或cfu/ml)控制菌藥用原料、輔料103102未作統一規定需氧微生物總數（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數（cfu/g或cfu/ml)控制菌中藥提取物103102未作統一規定中藥飲片未作統

38、一規定未作統一規定不得檢出沙門菌（10g)耐膽鹽革蘭陰性菌應小于104（1g)51微生物檢測體系及藥品微生物檢驗的關鍵點微生物檢測體系及藥品微生物檢驗的關鍵點環境保證環境保證培養基保證培養基保證藥品微生物藥品微生物實驗室規范實驗室規范指導原則指導原則潔凈實驗室微生物潔凈實驗室微生物控制和監測指導原則控制和監測指導原則無菌檢查隔離無菌檢查隔離系統指導原則系統指導原則SOP操作操作有效的方法有效的方法方法適用性（驗證）方法適用性（驗證）有效的結果有效的結果可靠的結論可靠的結論結果判斷結果判斷無菌性檢查無菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查對照培養基對照培養基藥品微生物檢驗藥品微生物檢驗替代方法驗證替代方法

39、驗證指導原則指導原則微生物檢查微生物檢查法指導原則法指導原則522015版藥典修訂的基本目標版藥典修訂的基本目標v2015年版中國藥典微生物檢驗標準體系將推動年版中國藥典微生物檢驗標準體系將推動藥品微生物實驗室從一個簡單的藥品微生物實驗室從一個簡單的終產品檢驗終產品檢驗實實驗室向驗室向微生物風險調查分析型微生物風險調查分析型實驗室方向發展。實驗室方向發展。 案例介紹53v氟康唑注射液生物負荷偏差調查及處理氟康唑注射液生物負荷偏差調查及處理v 2011年7月，在進行趨勢分析時，發現有5批 氟康唑注射液灌裝后生物負荷監測有超限趨勢，經過初步評估后，負責污染問題的委員會決定啟動偏差調查，查明導致產生

40、污染的根本原因、確定和實施相關預防措施，并監測其有效性。54v （1）確定調查范圍：根據產品發生情況和調查時間，）確定調查范圍：根據產品發生情況和調查時間，調查相關批號調查相關批號206個。個。v （2）鑒定：根據細菌鑒定，氟康唑注射液瓶中的微生）鑒定：根據細菌鑒定，氟康唑注射液瓶中的微生物有兩種：一種為水里存在的微生物，一種為環境存在物有兩種：一種為水里存在的微生物，一種為環境存在的微生物。的微生物。v （3）調查發生原因：一是注射用水連接管路在技術夾）調查發生原因：一是注射用水連接管路在技術夾層中有一個低點，有存水；二是洗瓶間的一個空氣過濾層中有一個低點，有存水；二是洗瓶間的一個空氣過濾器檢漏有問題。器檢漏有問題。 制定改正措施55v 改正措施改正措施1-管路坡度修正：管路用管路坡度修正：管路用5%NaOH進行鈍化、進行鈍化、滅菌；灌裝前增加一個過濾器；增加灌裝前后取樣檢測滅菌；灌裝前增加一個過濾器；增加灌裝前后取樣檢測頻次；注射用水循環管路每周滅菌一次。頻次；注射用水循環管路每周滅菌一次。v 改正措施改正措施2-更換過濾器：用更換過濾器：用m m的過濾器取代的過濾器取代m m的過濾器。的過濾器。v 改正措施改正措施3 3-注射劑產品在生產過程中的各個階段進行微注射劑產品在生產過程中的各個階段進行微生物檢測，以核