1、第十章第十章 高效液相色譜分析高效液相色譜分析10-110-1高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 高效液相色譜法高效液相色譜法(High Performance Liquid (High Performance Liquid ChromatographyChromatography，HPLC)HPLC)是二十世紀是二十世紀7070年代迅速年代迅速發展起來的一項新穎快速的分離分析技術。發展起來的一項新穎快速的分離分析技術。 高效液相色譜在經典的高效液相色譜在經典的“液相色譜液相色譜”基礎基礎上，引入了氣相色譜法的理論，技術上采用了上，引入了氣相色譜法的理論，技術上采用了高壓泵高壓泵、高效固

2、定相高效固定相和和高靈敏度檢測器高靈敏度檢測器，實現，實現了分析速度快，分離效能高和操作自動化。了分析速度快，分離效能高和操作自動化。該方法的幾個突出特點：該方法的幾個突出特點：(1)(1)高壓：高壓： 液相色譜以液體作為流動相液相色譜以液體作為流動相( (稱為載液稱為載液) )，液，液 體流經色譜柱受到的阻力較大，為使體流經色譜柱受到的阻力較大，為使載液迅載液迅 速通過速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般色譜柱，必須對載液施加高壓。一般 可達到可達到150150300kg/cm300kg/cm2 2。(2)(2)快速：快速： 由于使用了高壓，由于使用了高壓，HPLCHPLC所需的時間較之經

3、典所需的時間較之經典 液相色譜短得多，如分離苯的羥基化合物七液相色譜短得多，如分離苯的羥基化合物七 個組分，只需個組分，只需1 1分鐘；分鐘；對氨基酸的分離，對氨基酸的分離，經典液相色譜需用經典液相色譜需用2020小時才能分離出小時才能分離出2020種氨基種氨基酸，而酸，而HPLCHPLC只需只需1 1小時即可完成。小時即可完成。載液在色譜柱載液在色譜柱內的流速可達內的流速可達1 110mL10mLminmin-1-1。(3)(3)高效：高效： 氣相色譜的柱效（氣相色譜的柱效（n n值）約為值）約為20002000塔板塔板/m/m，而，而高效液相色譜約為高效液相色譜約為50005000塔板塔板

4、/m/m以上；一根以上；一根高效液高效液相色譜柱可同時分離多達相色譜柱可同時分離多達100100種以上的組分。種以上的組分。(4)(4)高靈敏度：高靈敏度： 由于在由于在HPLCHPLC中使用高靈敏度的檢測器，如紫中使用高靈敏度的檢測器，如紫外檢測器的最小檢測量可達外檢測器的最小檢測量可達1010-9-9g g，熒光檢測器熒光檢測器可達可達1010-11-11克；所需試樣為微升級。克；所需試樣為微升級。HPLCHPLC與與GCGC相比較的突出優點：相比較的突出優點： 用用GCGC法分析樣品須先氣化，目前已知的有機法分析樣品須先氣化，目前已知的有機 物中，能直接采用物中，能直接采用GCGC法進行

5、分析的僅占法進行分析的僅占20%20%。 而而HPLCHPLC法則不受此限制，尤其適合于分析生法則不受此限制，尤其適合于分析生 物、醫學方面的大分子及離子型化合物。物、醫學方面的大分子及離子型化合物。 HPLCHPLC方法中，有兩個相與樣品分子相互作用方法中，有兩個相與樣品分子相互作用 ，而，而GCGC方法方法中一般認為只有一個相與樣品分中一般認為只有一個相與樣品分 子相互作用。所以子相互作用。所以HPLCHPLC的選擇性大大提高。的選擇性大大提高。 HPLCHPLC方法中，因為在常溫下進行分析，因此方法中，因為在常溫下進行分析，因此 固定相的選擇比固定相的選擇比GCGC多；另一方面可提高色譜

6、多；另一方面可提高色譜 的分離效率。的分離效率。 HPLCHPLC方法中，可使用靈敏度較高的光度檢測方法中，可使用靈敏度較高的光度檢測 器，而在器，而在GCGC方法中則無法使用。方法中則無法使用。 HPLCHPLC方法中，樣品可以回收，而方法中，樣品可以回收，而GCGC方法中樣品方法中樣品 回收則較困難。回收則較困難。10-2 HPLC10-2 HPLC色譜儀色譜儀高效液相色譜儀的結構如下：高效液相色譜儀的結構如下： 由貯液瓶由貯液瓶、高壓泵、高壓泵( (梯度洗提裝置梯度洗提裝置) )、進樣器、進樣器、色譜柱色譜柱( (恒溫器恒溫器) )、檢測器和記錄儀組成。、檢測器和記錄儀組成。主要部件簡述

7、：主要部件簡述：1.1.高壓泵高壓泵 其作用是輸送其作用是輸送載液載液( (流動相流動相) )。由于色譜柱很細。由于色譜柱很細 (1(16mm)6mm)，填充劑粒度小，填充劑粒度小( (幾十微米幾十微米) )，因此要，因此要 達到快速高效的分離效果，要求壓力為達到快速高效的分離效果，要求壓力為150150 200kg/cm 200kg/cm2 2。2.2.梯度洗提裝置梯度洗提裝置 又稱又稱梯度洗脫梯度洗脫(gradient elution)(gradient elution)和氣相色譜和氣相色譜 法中的程序升溫類似，對復雜混合物的分離帶法中的程序升溫類似，對復雜混合物的分離帶 來方便。來方便。

8、 所謂梯度洗提，指載液中含有兩種或兩種以所謂梯度洗提，指載液中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續改變載液中各溶劑的配比。連續改變載液中各溶劑的配比。由此通過改變由此通過改變載液的極性來達到分離組分，提高分離效果。載液的極性來達到分離組分，提高分離效果。3.3.進樣裝置進樣裝置因為流路中為高壓力工作狀態，通常使用耐高因為流路中為高壓力工作狀態，通常使用耐高 壓的六通閥進樣裝置。壓的六通閥進樣裝置。4.4.色譜柱色譜柱 常用的標準柱型是內徑常用的標準柱型是內徑4.64.6或或3.9mm3.9mm，長度為，長度為151530cm30c

9、m的直形不銹鋼管。填料粒度的直形不銹鋼管。填料粒度5 51010 m m，柱，柱效以理論塔板數計大約效以理論塔板數計大約700070001000010000。其。其發展趨勢發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。5.5.檢測器檢測器常用的檢測器：常用的檢測器：(1)(1)紫外光度檢測器紫外光度檢測器(UV)(UV)： 它的作用原理是基于被分析試樣對特定波長它的作用原理是基于被分析試樣對特定波長紫外光的選擇性吸收。池內樣品濃度與吸收的紫外光的選擇性吸收。池內樣品濃度與吸收的光強度服從比耳定律。光強度服從比耳定律。P.304.P.304. 最小檢測量為最小檢測量為1

10、010-9-9g gmLmL-1-1，對流量和溫度的波，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。動不敏感，可用于梯度洗脫。紫外檢測器的缺點：不適用于紫外光完全不吸紫外檢測器的缺點：不適用于紫外光完全不吸收的試樣，溶劑的選用也受到一定的限制。收的試樣，溶劑的選用也受到一定的限制。 光電二極管陣列光電二極管陣列(photo-diode array (photo-diode array detector)detector)檢測器是紫外檢測器的重要進展。檢測器是紫外檢測器的重要進展。10241024個二極管陣列，各檢測特定波長，通過計個二極管陣列，各檢測特定波長，通過計算機快速處理，形成三維立體譜圖

11、，如圖所示。算機快速處理，形成三維立體譜圖，如圖所示。(2)(2)差示折光檢測器：差示折光檢測器：偏轉式差示折光檢測器光路圖偏轉式差示折光檢測器光路圖 光源光源1 1射出光線由射出光線由透鏡透鏡2 2聚焦聚焦, ,透過遮透過遮光板光板4 4的狹縫的狹縫, ,經反經反射鏡射鏡5 5反射后反射后, ,由透由透鏡鏡6 6匯聚兩次匯聚兩次, ,穿過穿過工作池工作池7 7和參比池和參比池8 8 該檢測器是繼該檢測器是繼UVUV檢測器之后，第二種廣泛使檢測器之后，第二種廣泛使用的液相色譜檢測器。圖示：用的液相色譜檢測器。圖示：被平面反射鏡被平面反射鏡9 9反射出來，成像于棱鏡反射出來，成像于棱鏡1111的

12、棱口的棱口上，光束均勻分為兩束，到達對稱的光電管上，光束均勻分為兩束，到達對稱的光電管1212上。上。 如果工作池和參比池皆通過純流動相如果工作池和參比池皆通過純流動相，光，光束無偏轉，左右兩個光電管的信號相等；束無偏轉，左右兩個光電管的信號相等； 如果工作池中有試樣通過，由于折射率改變，如果工作池中有試樣通過，由于折射率改變，造成光束偏轉，從而使到達棱鏡的光束偏離棱口，造成光束偏轉，從而使到達棱鏡的光束偏離棱口，左右兩個光電管接受的光能量不等，其差值正比左右兩個光電管接受的光能量不等，其差值正比于試樣的濃度。于試樣的濃度。 每種物質都有各自不同的折射率，因此都可每種物質都有各自不同的折射率，

13、因此都可用差示折光檢測器進行檢測，所以是一種通用型用差示折光檢測器進行檢測，所以是一種通用型的濃度檢測器。的濃度檢測器。靈敏度為靈敏度為1010-7-7g gmLmL-1-1。 缺點：對溫度變化很敏感，此檢測器不能缺點：對溫度變化很敏感，此檢測器不能用于梯度洗提。用于梯度洗提。3-3 HPLC3-3 HPLC的理論基礎簡述的理論基礎簡述 高效液相色譜法的理論基礎基本與氣相色高效液相色譜法的理論基礎基本與氣相色譜法相同，但有其不同之處。兩者的主要區別譜法相同，但有其不同之處。兩者的主要區別在于在于流動相流動相的不同。的不同。根據速率理論，根據速率理論，HPLCHPLC中影響柱效的因素如下：中影響

14、柱效的因素如下： 渦流擴散項渦流擴散項H He e H He e=2=2 d dp p 其含義與氣相色譜法相同。其含義與氣相色譜法相同。2.2.縱向擴散項縱向擴散項 H Hd d 式中式中C Cd d為常數，為常數，D Dm m為分子在流動為分子在流動相中的擴散系數。相中的擴散系數。由于分子在液體中的擴散系數比在氣體中小由于分子在液體中的擴散系數比在氣體中小4 45 5個數量級，當流動相的線速度個數量級，當流動相的線速度0.5cm0.5cms s-1-1，該項，該項對對H H的影響可忽略不計。而的影響可忽略不計。而GCGC中該項的影響則很中該項的影響則很大。大。3.3.傳質阻力項傳質阻力項 與

15、與GCGC類似，類似， HPLCHPLC也可分為也可分為固定相傳質阻力固定相傳質阻力項項和和流動相傳質阻力項流動相傳質阻力項。dmdC DHu固定相傳質阻力固定相傳質阻力H Hs s主要發生在液液分配色譜主要發生在液液分配色譜中，類似于氣液色譜中的液相傳質阻力項。中，類似于氣液色譜中的液相傳質阻力項。 式中式中C Cs s 為常數為常數( (與與k k有關有關) )；D Ds s為組為組分分子在固定液內的擴散系數；分分子在固定液內的擴散系數；由上式可見，由上式可見，H Hs s與與GCGC中的中的C CL L含義是一致的。含義是一致的。 流動相傳質阻力流動相傳質阻力HPLCHPLC中該項有兩種

16、形式，分為中該項有兩種形式，分為在流動的流動相中在流動的流動相中和和滯留的流動相中滯留的流動相中的傳質阻力，的傳質阻力，分別用分別用H Hm m和和H Hsmsm表示。表示。2sfssC dHuD式中式中C Cm m是常數是常數( (與與k k有關有關) )，D Dm m 為組為組分分子在流動相中的擴散系數。分分子在流動相中的擴散系數。式中式中Csm為一常數；為一常數； 綜上所述，由柱內色譜峰擴展所引起的塔板高度綜上所述，由柱內色譜峰擴展所引起的塔板高度的變化可歸納為：的變化可歸納為：2mpmmC dHuD將上式簡化：將上式簡化： H= A + B/u + CuH= A + B/u + Cu2

17、smpsmmC dHuD 可見，減小填料的孔徑和粒度，采用低粘度可見，減小填料的孔徑和粒度，采用低粘度及低流速流動相，適當提高溫度等方法都可提高及低流速流動相，適當提高溫度等方法都可提高柱效。柱效。 由由H H d dp p2 2可知，其中減小填料粒度是提高柱可知，其中減小填料粒度是提高柱效的最有效途徑；因孔穴深度也同時隨之減小。效的最有效途徑；因孔穴深度也同時隨之減小。 總結：總結：HPLCHPLC速率方程式形式與速率方程式形式與GCGC一致，其主要一致，其主要區別在于區別在于HPLCHPLC縱向擴散項縱向擴散項(Hd )可以忽略不計，可以忽略不計，影響柱效的主要因素是影響柱效的主要因素是渦

18、流擴散項渦流擴散項He和傳質阻和傳質阻力項力項Hm、Hsm 、Hs。3-4 HPLC3-4 HPLC的主要類型及其分離原理的主要類型及其分離原理根據分離機制的不同，根據分離機制的不同，HPLCHPLC可分為下述幾種主可分為下述幾種主要類型：要類型：液液-液色譜法液色譜法、液液-固色譜法固色譜法、離子交換離子交換色譜法色譜法、離子對離子對色譜法色譜法、離子、離子色譜法和色譜法和空間排阻色譜法空間排阻色譜法等等。1.1.液液- -液分配色譜法液分配色譜法(L-L partition chromatograph)(L-L partition chromatograph) 流動相和固定相都是液體，其分

19、離原理為試流動相和固定相都是液體，其分離原理為試樣組分在固定相和流動相之間的相對溶解度存樣組分在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差異。當濃度分配達到平衡時，應服從于下在差異。當濃度分配達到平衡時，應服從于下式：式：sMMsCVKkkCV液液- -液分配色譜主要有兩種類型：液分配色譜主要有兩種類型： 正相液正相液-液分配色譜液分配色譜 用于分離極性較強的水溶性樣品，非極性或弱用于分離極性較強的水溶性樣品，非極性或弱 極性的物質不易被保留，出峰較早。極性的物質不易被保留，出峰較早。 反相液反相液-液分配色譜液分配色譜 用于分離水溶性較差的樣品，出峰次序與正相用于分離水溶性較差的樣品，出峰次序與正

20、相 的相反，極性組分先被洗脫。的相反，極性組分先被洗脫。特點：色譜柱制備的重現性較好；缺點：特點：色譜柱制備的重現性較好；缺點： 分離分離過程中由于流動相通過色譜柱時的機械沖擊，過程中由于流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定液會不斷流失而導致柱的保留行為變化。固定液會不斷流失而導致柱的保留行為變化。 為此將各種有機基團通過化學反應鍵合上擔體為此將各種有機基團通過化學反應鍵合上擔體表面，代替機械涂漬的液體固定相，如此可克表面，代替機械涂漬的液體固定相，如此可克服該方法的缺點。服該方法的缺點。2.2.液液- -固色譜法固色譜法(L-S adsorption (L-S adsorption chrom

21、atographchromatograph) ) 流動相為液體，固定相為吸附劑。根據物質流動相為液體，固定相為吸附劑。根據物質對對 組分分子吸附作用的不同來進行分離。組分分子吸附作用的不同來進行分離。該方法適用于分離脂溶性試樣，該方法適用于分離脂溶性試樣，對具有不同官能對具有不同官能團的化合物和異構體有較高的選擇性。團的化合物和異構體有較高的選擇性。缺點：由缺點：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現象。于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現象。3.3.離子交換色譜法離子交換色譜法(ion-exchange chromatography)(ion-exchange chromatography) 該方法

22、是基于離子交換樹脂上可電離的離該方法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中攜帶相同電荷的組分離子進行可子與流動相中攜帶相同電荷的組分離子進行可逆交換，依據這些離子對交換劑的不同親和力逆交換，依據這些離子對交換劑的不同親和力而進行分離。而進行分離。凡是在溶劑中凡是在溶劑中能電離的物質能電離的物質通常都可用離子交通常都可用離子交換色譜法進行分析。換色譜法進行分析。 離子交換色譜法主要用來分離離子交換色譜法主要用來分離離子離子或或可離可離解的化合物解的化合物，2020世紀世紀6060年代前后，已成功分離年代前后，已成功分離了氨基酸、核酸、蛋白質等，在生物化學領域了氨基酸、核酸、蛋白質等，在生物化

23、學領域得到了廣泛的應用。得到了廣泛的應用。3344()()()()MNa O SMO SNaXClR NXR NCl ：- - -載載液液中中 載載液液中中載載液液中中 載載液液中中陽陽離離子子交交換換：樹樹脂脂樹樹脂脂 + +陰陰離離子子交交換換樹樹脂脂樹樹脂脂 + + 空間排阻色譜法以凝膠空間排阻色譜法以凝膠(gel)(gel)為固定相。分為固定相。分離機理與其它色譜法完全不同。離機理與其它色譜法完全不同。 該方法分離的機理類似分子篩的作用，但孔該方法分離的機理類似分子篩的作用，但孔徑比分子篩要大，為數納米到數百納米。溶質在徑比分子篩要大，為數納米到數百納米。溶質在兩相間的分離不是由于相互

24、作用力的不同，而是兩相間的分離不是由于相互作用力的不同，而是按分子大小進行分離。按分子大小進行分離。4.4.空間排阻色譜法空間排阻色譜法(steric exclusion (steric exclusion chromatographchromatograph) ) 試樣中的大分子不能進入膠孔而受試樣中的大分子不能進入膠孔而受到排阻，就直接通過柱子首先在色譜圖到排阻，就直接通過柱子首先在色譜圖上出現；另外一些小分子可以進入膠孔上出現；另外一些小分子可以進入膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。留值最大，在色譜圖上最后出現。 排阻色

25、譜法中，載液排阻色譜法中，載液分子通常都很小，它們一分子通常都很小，它們一般最后被洗脫般最后被洗脫(t(tM M最大最大) )，結果是：整個試樣都在結果是：整個試樣都在t tM M( (死時間死時間) )以前洗脫。以前洗脫。 由于由于排阻色譜法的排阻色譜法的分離機理與其他色譜法分離機理與其他色譜法不同，具有幾個突出的不同，具有幾個突出的特點：特點：(1)(1)試樣峰全部在溶劑的保留時間前出峰，它們試樣峰全部在溶劑的保留時間前出峰，它們 在柱內的停留時間短，故柱內產生的峰擴展在柱內的停留時間短，故柱內產生的峰擴展 比其他方法小得多。比其他方法小得多。(2)(2)固定相和流動相的選擇簡便。固定相和

26、流動相的選擇簡便。(3)(3)適用于分離相對分子質量差別在適用于分離相對分子質量差別在10%10%以上的以上的 分子。分子。 GC GC中可供選擇的載氣只有三四種，它們的中可供選擇的載氣只有三四種，它們的性質差異不大。要提高柱的選擇性，主要是改性質差異不大。要提高柱的選擇性，主要是改變固定相的性質。變固定相的性質。3-6 HPLC3-6 HPLC的流動相的流動相 而而HPLCHPLC中，當固定相選定時，流動相的種類中，當固定相選定時，流動相的種類、配比能顯著地影響分離效果。選擇流動相時應、配比能顯著地影響分離效果。選擇流動相時應注意以下幾方面因素：注意以下幾方面因素： 純度純度 如溶劑不純，則

27、長期積累雜質會導致檢測如溶劑不純，則長期積累雜質會導致檢測器噪聲增加，同時也影響收集的餾分純度。器噪聲增加，同時也影響收集的餾分純度。(2)(2)避免使用引起柱效損失或保留特性變化的溶避免使用引起柱效損失或保留特性變化的溶 劑。劑。(3)(3)對試樣要有適宜的溶解度，否則在柱頭易產對試樣要有適宜的溶解度，否則在柱頭易產 生沉淀。生沉淀。(4)(4)考慮到泵壓，流動相的粘度小些為好。考慮到泵壓，流動相的粘度小些為好。(5)(5)應與檢測器相匹配，如紫外光檢測器，就不應與檢測器相匹配，如紫外光檢測器，就不 能使用對紫外光吸收的溶劑。能使用對紫外光吸收的溶劑。 常用溶劑的極性順序排列如下常用溶劑的極

28、性順序排列如下：水水( (極性最大極性最大) )、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、異丙酮、四氫呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、異丙醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、環醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、環己烷、煤油己烷、煤油( (極性最小極性最小) )。 溶劑還可采用二元或多元組合。根據分別所起溶劑還可采用二元或多元組合。根據分別所起的作用，采用的溶劑可分成的作用，采用的溶劑可分成底劑底劑及及洗脫劑洗脫劑兩種。兩種。 底劑底劑決定基本的色譜分離情況；決定基本的色譜分離情況；洗脫劑洗脫劑則起則起調節試樣組分的滯留并對某幾個組

29、分具有選擇性調節試樣組分的滯留并對某幾個組分具有選擇性的分離作用。的分離作用。 正相色譜中，正相色譜中，底劑底劑采用低極性溶劑如正己采用低極性溶劑如正己烷、苯、氯仿等；而烷、苯、氯仿等；而洗脫劑洗脫劑則根據試樣的性質則根據試樣的性質選取極性較強的針對性溶劑如醚、酯、酮、醇選取極性較強的針對性溶劑如醚、酯、酮、醇和酸等。和酸等。 反相色譜中，反相色譜中，底劑底劑一般采用水，一般采用水，洗脫劑洗脫劑常常采用有機溶劑如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。采用有機溶劑如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。 而離子交換色譜法主要在含水介質中進行而離子交換色譜法主要在含水介質中進行，組分的保留值可通過調節流動相中的離子強，組分的保留值可通過調節流動相中的離子強度和度和pHpH來控制。來控制。 排阻色譜所用的溶劑必須與凝膠本身非常排阻色譜所用的溶劑必須與凝膠本身非常相近，以潤濕凝膠并防止吸附作用。對分離大分相近，以潤濕凝膠并防止吸附作用。對分離大分子化合物，易采用粘度小的溶劑作流動相如四氫子化合物，易采用粘度小的溶劑作流動相如四氫呋喃、甲苯等。對分離生物物質，主要采用水、呋喃、甲苯等。對分離生物物質，主要采用水、緩沖鹽溶液等。緩沖鹽溶液等。3-7 HPLC3-7 HPLC分離類型的選擇分離類型的選擇 應用應用HPLCHPLC對試樣進行分離對試樣