1、離子色譜-脈沖安培法測定鏈霉素及雜質摘要：本文采用離子色譜-脈沖安培法測定鏈霉素以及其雜質的含量。采用Carbonpac PA1陰離子分析柱分離，以電化學為檢測器。用去離子水提取YPD發酵液的鏈霉素，以16000r/min的速度離心后，上清液稀釋100倍直接進樣分析。實驗結果表明，在一定的色譜條件下，鏈霉素及其雜質離子具體很好的線性，和重現性，及較低的檢出限。 關鍵詞：離子色譜；脈沖安培；鏈霉素 新霉素是水溶性的氨基糖苷類抗生素復合體，一般是從放射菌類鏈霉素的發酵產物中純化出來的，主要用于靜脈注射以治療感染。在臨床使用前，鏈霉素在使用之前必須測定主成分以及標注所有的雜質成分。氨基糖苷類抗生素及

2、其雜質的結構和糖類似，都沒有明顯的發色基團，用紫外可見光檢測器的靈敏度達不到要求。另外在制備和貯藏過程中引入的一些中間體或雜質具有較好的紫外或可見光吸收基團，使用紫外可見光檢測器直接進樣分析會有很大的干擾鏈霉素A及其雜質的定量。示差折光率檢測器與紫外可見光檢測器的局限性類似。在本文中采用高效陰離子交換色譜（HPAE）分離鏈霉素A及其雜質 13，17，選用的CarboPac PA1陰離子交換柱對鏈霉素A及其雜質進行分離，采用EG50淋洗液發生器，采用一次性金（Au）工作電極作為電化學檢測器的工作電極。此方法精確度好、檢出限低、線性和方法的重現性好17，25，26。圖1.檢測鏈霉素和二氫鏈霉素的色

3、譜圖2. 70和63mM NaOH分析鏈霉素的對比1實驗部分1.1 儀器及試劑Dionex ICS3000系統，包括D梯度雙泵 或者SP梯度單泵（帶有真空脫氣裝置和GM-4梯度混合裝置），DC檢測器模塊(帶雙溫控區)，20 uL進樣環，ECD電化學池配復合pH/Ag/AgCl參比電極，一次性金工作電極；AS自動進樣器（帶分流閥）以及2ml進樣瓶；Chremoleon工作站。氦氣（99.995）；過濾裝置，0.2 um尼龍膜過濾裝置；真空泵；聚丙烯自動進樣器小瓶；離心管（1.5ml）。 鏈霉素A（鏈霉素硫酸鹽，美國藥典準參考物質）試劑均購于Sigma-Aldrich。Bacto YPD Brot

4、h(Pfizer Consumer Healthcare, BD Laboratories, Cat# 0428-17-5)。標準溶液均由1000mg/L的貯備液（置于-40冰箱中）稀釋配制，溶液均用18.2M.cm 的二次去離子水配制。 1.2 色譜條件色譜柱：CarboPac PA1 分析柱，4 x 250 mm，CarboPac PA1保護柱；流速：0.5 mL/min；進樣體積：20 uL；溫度：柱溫30 °C，檢測器溫度25 °C；檢測器（ED50）：脈沖安培檢測器，AAA-Direct，一次性金電極，參比電極為pH模式；淋洗液通道A：水，淋洗液通道B：250mM

5、NaOH。 等度程序：分離的淋洗液濃度70 mM NaOH；梯度程序：0-22 min 70mM NaOH, 22-40 min 200 mM NaOH; 40-60min 70mM NaOH。 1.3 系統適應性樣品制備熱降解鏈霉素A會產生一系列的產物，但是單一主組分可用于確認色譜系統的分離度是否符合系統適應性實驗。主降解峰和鏈霉素A的分離度要大于3。準備系統適應性實驗，可在密封的玻璃瓶中放置1ml 30g/mL 鏈霉素B，加熱1小時。不要使用塑料的管子。 表1 鏈霉素A檢測電位1.4鏈霉素和雙氫二鏈霉素降解研究評價鏈霉素和雙氫二鏈霉素的雜質隨時間的變化是通過將樣品的溫度提高。在水中溶解41

6、鏈霉素和雙氫二鏈霉至少，加熱至75，加熱時間分別為0，60min以及24h。評價處理樣品中雜質含量的變化。 圖3.采用70mM NaOH分析USP和商品化鏈霉素硫酸鹽的對比圖1.5 YPD Broth Media樣品前處理溶解1.0g YPD 發酵液到20mL過濾的去離子水中。以16000r/min的速度離心10min,然后稀釋1000倍。回收率測定，加鏈霉素濃縮液到上清液中，然后稀釋至樣品中加入標樣的濃度為10。上清液直接進樣分析。 2結果與討論 2.1分離 圖2是采用CarbonPac PA1柱，70mM NaOH為流動相分析10 USP純鏈霉素A（峰8）以及柱死體積的色譜圖。鏈霉素A與其

7、雜質的分離取決于淋洗液的濃度。表上為淋洗液濃度與鏈霉素A保留時間的影響關系圖。在淋洗液50-77之間，淋洗液濃度的變化對出峰時間的影響最大。圖3比較了以63 mM NaOH和70mM NaOH為淋洗液分析譜圖對比。雖然采用63mMNaOH，雜質峰的分離度變大，但是分析速度變慢而且峰拖尾長。70mM NaOH為流動相的分離度可以達到分析的需求。雜質峰的出峰時間為8min(圖3，色譜A,峰12)，主要的雜質峰為鏈霉菌二糖胺。圖4為采用70mM NaOH分析10 USP鏈霉素硫酸鹽和其它商業化產品中雜質的含量的對圖。色譜A中的雜質譜圖與色譜圖B中的雜質譜圖有明顯地區別。表2 淋洗液濃度對鏈霉素A出峰

8、時間的影響如圖所示，鏈霉素A的與其它系統適應性色譜峰的分離度在一天內的范圍5.46-6.14,符合分離度大于3的要求。而不稱度因子的值為1.23-1.25符合不對稱度2的要求；理論塔板素為2209-2227，亦滿足10000的要求。通過熱降解產生的鏈霉素A系統適應性的色譜的出峰時間大約在160min（采用70mM NaOH），為了避免此色譜峰對下一針樣品分析產生干擾，在淋洗液的程序中可采用200mM NaOH進行清洗。具體的色譜圖如圖6所示。圖4.保留時間長的色譜峰2.2方法的線性范圍、精密度和最低檢測限 在0.4 pmol-40nmol的濃度區別范圍內考察線性，在本文的實驗中發現最優的響應區

9、間范圍為120-400pmol。鏈霉素A的峰面積對濃度的平均響應因子為0.0447±0.0006nC·min/pmol。在濃度在4-200M的濃度范圍區別內，標準曲線的相關系數（r2）的值為0.9976?；€，峰-峰的噪音通過空白運行的1min的范圍內?；€噪音的值為9.8-194 pC。最低檢出限計算是通過3倍的平均噪音除以抗生素的峰高-濃度響應因子。定量限的計算是通過10倍的平均噪音除以抗生素的峰高-濃度響應因子。鏈霉素A檢出限的值為1.7±1.4pmol;而定量限的值為5.6±4.5 pmol,具體的數據如表2所示?？疾旆椒ǖ姆€定性是通過測定連續3

10、4針同一樣品的各指數的相對標準偏差RSD。具體的數據如表功所示。 圖5. 檢測YPD發酵液中的鏈霉素A2.2 樣品測定和回收率測定 使用前面所說的色譜條件對真實樣品中的鏈霉素及其雜質進行測定。通過對比樣品色譜圖與標準溶液的保留時間進行定性。此樣品分析的難點在于樣品基體的干擾，這與樣品的前處理方法息息相關。在本文中，通過在稀釋1000倍的確YPD broth中加標10-41M標樣。分別加標10-41M，加標回收率分別為82.6±0.6%和92.9±0.6%，符合分析測試的要求。 3結論 HPAE-PAD（高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法）可有效分析鏈霉素A及雜質。此方法準確

11、，重現性好，數據可靠性高，完全符合美國藥典系統適應性數據測定的要求。采用HPAE-PAD方法分析，無需時耗時，耗力的樣品衍生反應?？偠灾枋龅姆椒`敏度高，峰面積好，保留時間的重現性優越而且分析速度快。 表3鏈霉素A的檢出限及線性參考文獻 1. Electronic Orange Book. Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations. U.S.Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for

12、 Drug Evaluation and Research, Office of Pharmaceutical Science, Office of Generic Drugs. Current through February, 2007 2. United States Pharmacopeia, The National Formulary.“Streptomycin Sulfate.” USP 30, NF 25; Volume 3, 2007; p. 3222. 3. United States Pharmacopeia, Pharmacopeial Forum, Streptomycin for Injection, 2002; 28 (1) 8688. 4. Bruton, J.; Horner, W.H. Biosynthesis of Streptomycin:III. Origin of the Carbon Atoms of Streptose.J. Biol. Chem. 1966, 241, 31423146. 5.Demain, A.L.; Inamine, E. Biochemistry and Regulation of Streptomy