1、 中 國 海 洋 大 學 實 驗 報 告 姓名： 周夢陽 專業年級： 07生物技術 學號： 040012007184 實驗時間：周二90節 教師： 孔凡娜 課程： 分子生物學實驗 題目： 基因組DNA的提取與電泳鑒定 一.【實驗目的】掌握基因組DNA的提取原理和方法二.【實驗原理】1、用機械的方法使組織和細胞破碎；加入SDS等離子型活性劑，溶解細胞膜和核膜蛋白；加入酚氯仿等表面活性劑使蛋白變性。離心，除去組織和變性蛋白，上清液中加入冰凍的無水乙醇使DNA沉淀，離心，棄上清，70%乙醇漂洗DNA；倒掉上清，風干，溶于滅菌的雙蒸水中。2、分子置于電場中以一定速度（遷移率）移向適當電極。遷移率同電場

2、強度、電泳分子所攜帶的靜電荷數成正比，還與介質的摩擦系數相關。一定電場強度下DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構型。3、瓊脂糖是D-和L-半乳糖殘基殘基通過(13)和(14)糖苷鍵交替構成的線狀聚合物。瓊脂糖凝膠可以形成直徑50nm-200nm的三維篩孔通道。瓊脂糖溶液的密度取決于瓊脂糖的濃度，我們所用的是經過化學修飾的低熔點（LMP）瓊脂糖，結構上比較脆弱，較低溫度下即可熔化。濃度越高，孔隙越小，分辨能力越強。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50Kb；聚丙烯酰胺凝膠分辨力為1bp-1000bp。4、凝膠電泳中，加入溴化乙錠（簡稱EtBr）染料對核酸分子染色之后，將電泳標本放

3、置在紫外光下觀察，便可以十分敏感兒方便地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶位置。三.【實驗材料與用品】材料：龍須菜用具：天平、離心管、高速離心機、水浴鍋、瓊脂糖凝膠電泳系統、瓊脂糖凝膠電泳系統等。藥品：液氮、緩沖液、SDS、蛋白酶K、tris飽和酚、氯仿、冰凍的無水乙醇、70%乙醇、RNA酶、TBE、瓊脂糖四.【實驗步驟】（一）基因組DNA的提?。?）將龍須菜從培養瓶中取出，吸干表面水分后用電子天枰秤取0.2g，液氮充分研磨后分裝到1.5ml的離心管中。（2）在裝有藻體粉末的離心管中加入900l提取緩沖液、90l 20%的SDS、10l 10mg/ml的蛋白酶K。充分混勻后于37水浴鍋中裂解30mi

4、n，每5min混勻一次。（3）12000轉離心10min，取上清。（4）加入等體積Tris飽和酚抽提，充分混勻后12000轉離心10min，取上清。（5）加入等體積氯仿抽提，充分混勻后12000轉離心10min，取上清。（6）加入等體積氯仿抽提，充分混勻后12000轉離心10min，取上清。（7）加入兩倍體積的無水乙醇，充分混勻后于-20半小時。（8）將上述溶液從冰箱中取出，12000轉離心10min，出現的沉淀即為基因組DNA。（9）倒掉上清，加入800l 70%的無水乙醇，洗沉淀，12000轉離心10min。洗兩次。（10）倒掉上清后，將沉淀晾干后加入50去離子水溶解。 （11）加入Rna

5、se消化30min。（12）-20保存備用（二）基因組DNA的電泳檢測（1）配制1%的Agarose膠(1gAgarose粉末，融于100ml1×TAE中)（2）分別在樣品槽中加入標準DNA marker和樣品DNA 3l（buffer與樣品DNA的混合物），電泳。（3）將瓊脂糖膠放在EB溶液中染色5-10分鐘。（4）使用凝膠成像系統拍照并檢驗。五.【實驗結果】我們是第2組，由下圖可見無明顯條帶，這說明樣品中混有蛋白質雜質，抽提不完全。六.【思考題】1、簡述DNA提取過程中各種試劑的作用。SDS：破壞細胞膜結構，使蛋白質變性，解聚核糖體，使DNA得以釋放。蛋白酶K：降解蛋白質乙醇：沉

6、淀DNATris：緩沖液EDTA：螯合劑，螯合酶活性中心的金屬離子，從而抑制DNase的活性酚氯仿：使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚抽提過程中，蛋白質與DNA分離，蛋白質與苯酚相似相溶，DNA溶于水相，離心分離后保持水相，加入酒精沉淀DNA。重蒸水：吸取DNA上面所粘附的離子RNA酶：降解混雜在DNA 中的RNA 2、簡述DNA提取過程中需要注意哪些問題。1）材料量不能太多,氯仿的加入量不能太少,且要充分搖勻,否則蛋白質變性不完全。2）苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發，具有神經毒作用，操作時應注意防護。3） 操作要

7、快，酚暴露在空氣和光線下易被氧化，呈紅色。4）收集細胞的多少是實驗成功與否的關鍵；5）沉淀中加1ml STE后，打散細胞團便于充分消化細胞；6）飽和酚吸取時記得吸取下層的有機相；7）乙醇沉淀時，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。3、查閱資料簡單介紹通過紫外分光光度計給核酸定量的原理。分光光度計計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當于