1、紅細胞滲透脆性實驗Measuring for erythrocyte osmotic fragility【教學對象與學時】一、教學對象：五年制本科二、學時：4學時【預習要求】預習紅細胞生理特性【目的要求】一、 操作：學習用試管法測定紅細胞滲透脆性二、 理論：1.了解紅細胞滲透脆性實驗的原理。2. 觀察紅細胞對不同滲透張力的細胞外溶液的抵抗力，進一步理解細胞外液滲透張力對維持紅細胞正常形態與功能的重要性。【重點和難點】一、重點1. 準確配制不同滲透張力的溶液，掌握正確的紅細胞滲透脆性測量方法。2. 理解紅細胞滲透脆性實驗的原理。二、難點1. 準確配制不同滲透張力的溶液。2. 掌握正確的紅細胞滲透

2、脆性測量方法。【教學過程設計】1. 課前提問和預習檢查。2. 講解紅細胞滲透脆性實驗的原理。3. 介紹不同滲透張力溶液的配制法和抗凝血液的制備。4. 學生分組進行實驗，觀察紅細胞對蒸餾水、1.9%尿素溶液和不同濃度的NaCl溶液的抵抗力。5. 實驗結束前匯總全班實驗結果，討論實驗結果，理解實驗結果出現的原因。【課前預習檢查或提問】一、 何謂紅細胞滲透脆性？其正常值是多少？二、 影響紅細胞滲透脆性的因素有哪些？【課前講解】一、 實驗設計的原理將紅細胞懸浮于低滲鹽溶液中，水將在滲透壓的作用下滲入細胞，于是紅細胞發生膨脹，由正常的雙凹圓碟形(圖1A)變成球形（圖1B），并開始破裂而發生溶血。紅細胞在

3、低滲鹽溶液中發生膨脹破裂的現象稱紅細胞滲透脆性。但紅細胞對低滲鹽溶液具有一定的抵抗力，這種抵抗力的大小可作為衡量紅細胞滲透脆性的指標。對低滲鹽溶液抵抗力小，表示滲透脆性高；相反，則表示滲透脆性低。同一個體的紅細胞對低滲鹽溶液的抵抗力并不相同。將血液滴入不同濃度的低滲NaCl溶液中可檢測其抵抗力的大小，剛開始出現溶血的NaCl溶液濃度為該血液中紅細胞的最小抵抗力；出現完全溶血溶液濃度，為該血液中紅細胞的最大抵抗力。前者代表紅細胞的最大滲透脆性，后者代表紅細胞的最小滲透脆性。生理學上將滲透壓與血漿的滲透壓相等的溶液稱為等滲溶液；能使懸浮于其中的紅細胞保持正常體積和形態的溶液稱為等張溶液。等滲溶液不

4、一定是等張溶液，如1.9%的尿素溶液雖是等滲溶液，但不是等張溶液；而等張溶液溶液一定是等滲溶液，如濃度為0.85%的NaCl溶液既是等滲溶液又是等張溶液。 A B圖1. 紅細胞形態 (A:正常；B：低滲NaCl溶液中球形紅細胞).二、實驗方法1. 制備不同濃度的NaCl溶液。先配制1%濃度的低滲NaCl溶液100ml，然后取口徑相同的干凈小試管12支，編號排列在試管架上，按下表分別向各試管內加入1%NaCl溶液和蒸餾水后混勻，配制成12種0.68%0.24%不同濃度的低滲NaCl溶液(圖2) 圖2 用于配制低滲NaCl溶液的試管 表1 紅細胞滲透脆性實驗中不同濃度的NaCl溶液配制法試管編號

5、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121%NaCl溶液（ml） 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸餾水（(ml) 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9NaCl溶液濃度（%）0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.242. 分別配制0.85%濃度的NaCl溶液、1.9%濃度的尿素溶液。另取3支小試管，編號1315，分別盛2.5ml 0.85%NaCl溶液、1.9%尿素溶液和蒸餾水。3. 碘酒

6、、酒精消毒皮膚后用滅菌干燥的、肝素濕潤的注射器從肘正中靜脈取血2ml（圖3），立即混勻，將其中1ml加入試管，余血依次向15支試管內各加入1滴（圖4），輕輕混勻。肘正中靜脈圖3. 上臂大靜脈 圖4. 向試管內加血示意圖 4. 觀察13、14、15管的變化，其余12管在室溫下靜置1小時，然后觀察混合液的顏色和透明度。1） 試管內液體完全變成透明紅色，說明紅細胞全部破裂，稱完全溶血（圖5A）。2） 試管內液體下層為混濁紅色，上層為透明紅色，表示部分紅細胞破裂，稱不完全溶血（圖5B）。3） 試管內下層為混濁紅色，上層無色透明，說明紅細胞全部沒有破壞（圖5C）。CBA 圖5. 溶血程度示意圖5. 記錄

7、實驗結果。包括受試者姓名和紅細胞滲透脆性范圍（即最小抵抗力的NaCl溶液濃度和最大抵抗力的NaCl溶液濃度）以及1315管的結果。6. 取第6管和第13管混合液各1滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察紅細胞形態。圖6. 等滲NaCl溶液中紅細胞形態 成敗關鍵（注意事項） 1. 血液最好新鮮制備。 2. 準確配制不同濃度的低滲鹽溶液。 3. 所有玻璃器皿要求干燥清潔。 4. 向試管內滴加血液時不可用力擠壓，不可將血泡沫注入試管。混勻含紅細胞的液體時動作應輕，以免造成溶血。 5. 觀察溶血情況時以白色為背景。 6. 為使各管加血量相同，加血時持針角度應一致。 7. 各試管應準確編號。 8. 玻

8、璃器皿應小心輕放，以免損壞。【典型結果】1. 紅細胞滲透脆性實驗結果（表2） 表2 紅細胞滲透脆性實驗結果試管編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15結 果2. 第6管和第13管混合液中紅細胞形態 第6管：第13管：【分析討論】一、 結果分析二、 非預期結果及可能原因分析【參考結論】【實驗報告要點】1. 列表記錄紅細胞滲透脆性實驗結果。2. 記錄第6管和第13管混合液中紅細胞形態觀察結果。3. 討論結果產生的原理。4. 結論。【思考題】一、 為什么同一個體的紅細胞滲透脆性有最大值和最小值？二、 紅細胞在等滲的1.9%尿素溶液中會發生什么現象？為何出現這種現象

9、？【參考內容】一、紅細胞滲透脆性實驗的臨床意義測定紅細胞滲透脆性是一種生物學實驗，它能夠檢測出紅細胞膜對由于胞內水聚集所造成的物理牽張力的抵抗能力。這主要取決于紅細胞表面積與其體積之比。表面積大而體積小對低滲鹽水抵抗力較大(脆性較小)；反之，則脆性增加。正常參考值：0.46%0.42%的NaCl溶液開始溶血；0.34%0.32% 的NaCl溶液完全溶血。    患者與正常對照，溶血管的NaCl濃度相差0.4%具有診斷價值。從診斷學的觀點來看，紅細胞滲透脆性實驗能分辨出以下兩種不同的病理狀態：紅細胞滲透脆性增高見于：遺傳性球形紅細胞增多癥，自身免疫性溶血性貧血伴繼發

10、球形紅細胞增多等。某些藥物或過冷、過熱也可引起。紅細胞滲透脆性減低見于：缺鐵性貧血，各型地中海貧血，鐮形細胞貧血，脾切除，阻塞性黃疸等。二、紅細胞滲透脆性實驗的其他方法（一）紅細胞孵育滲透脆性試驗(RIOFT)本試驗是將血液置37孵育24h后，進行滲透脆性試驗。在孵育過程中，紅細胞能源消耗，貯備的ATP減少，導致需要能量的紅細胞膜對陽離子的主動傳遞受阻，造成鈉離子在RBC內集聚，細胞膨脹，孵育滲透脆性增加。有細胞膜缺陷及某些酶缺陷的RBC能源很快耗盡，孵育滲透脆性明顯增加。參考值：未孵育：50%溶血為0.40%0.45% NaCl溶液；37孵育24h：50%溶血為0.46%0.60% NaCl

11、溶液。臨床意義 1.本試驗用于輕型遺傳性球形紅細胞增多癥、先天性非球形紅細胞溶血性貧血的診斷和鑒別診斷。2.增加：見于遺傳性球形紅細胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細胞增多癥、先天性非球形細胞溶血性貧血。3.減低：見于地中海貧血、缺鐵性貧血、鐮狀細胞貧血、脾切除術后。（二）全自動智能紅細胞脆性檢測系統檢測管放入RC，蓋好，按OK，讀數。全自動智能紅細胞脆性檢測系統是一種臨檢用紅細胞脆性檢測系統，包括紅細胞脆性檢測儀-ERYFRATEST READER及檢測試劑-ERYFRATEST MONOTEST，可用于檢測紅細胞滲透脆性（EOF）和紅細胞滲透阻力（EOR）。本系統采用紅細胞脆性檢測儀及M

12、onotest檢測試劑盒進行體外紅細胞滲透阻力的定量檢測。微型、簡易的紅細胞脆性檢測系統盡可在醫生辦公室、在病房、在病人床頭使用。首次實現了取血數分鐘內即可獲得紅細胞脆性定量結果。三、何謂地中海貧血？地中海貧血（Thalassemia）簡稱海貧或海洋性貧血，于 1925 年由 Cooley 和 Lee 首先描述，最早發現于地中海區域，當時稱為地中海貧血，國外亦稱海洋性貧血。實際上，本病遍布世界各地，以地中海地區、中非洲、亞洲、南太平洋地區發病較多。在我國以廣東、廣西、貴州、四川為多。這是一類由于常染色體遺傳性缺陷，引起珠蛋白鏈合成障礙，使一種或幾種珠蛋白數量不足或完全缺乏，因而紅細胞易被溶解破

13、壞的溶血性貧血。我國自然科學名詞審定委員會建議本病的名稱為珠蛋白生成障礙性貧血，習慣上仍稱為地中海貧血。呈小細胞低色素性貧血，紅細胞大小不均，可見異形，靶形紅細胞 (可有 0-66 ) ，網織紅細胞增多。紅細胞滲透脆性降低。有種族和家族史特征。【專業英語選讀】Osmotic fragilityBeutler E,Lichtman M,Coller B,et al. Williams Hematology,5th ed .New Yock, McGraw-Hill, 19951. The osmotic fragility test is a simplified means of estima

14、ting the surface area/volume ratio of erythrocytes. As this ratio falls the cell becomes more sensitive to osmotic lysis. Its greatest usefulness is in the diagnosis of hereditary spherocytosis, but it has also been used in screening for thalassemia.2. Either heparinized or defibrinated blood is sui

15、table for osmotic fragility studies. 3. It is usually desirable to determine the osmotic fragility both of the freshly drawn blood and of autoincubated blood. For the latter, 2 ml of the sterile blood is placed in a sterile 5-ml screw-cap vial and incubated for 24 h at 37. A series of solutions cont

16、aining phosphate-buffered sodium chloride solutions equivalent in osmolarity from 0.15 to 0.80% NaCl are dispensed into tubes. A one-hundredth volume of blood is added to each tube, as well as to a tube containing distilled water, which serves as the blank. After being allowed to stand at room tempe

17、rature for 60 min, the tubes are centrifuged and optical density of the supernatant is read at 540 nm.4. The percent hemolysis in each tube is calculated as follows:% hemolysis = (ODs-ODB)×100 OdoWhere ODs is the optical density in a supernatant, ODB is the optical density of the 0.09% saline s

18、upernatant, and ODo is the optical density of the distilled water tube. 5. The normal range of values is presented as follows:NaCl, % Lysis, %Fresh Incubated0.20 95-1000.30 97-100 85-1000.35 90-99 75-1000.40 50-95 65-1000.45 5-45 55-950.50 0-6 40-850.55 0 15-700.60 0-400.65 0-100.70 0-50.75 06. Cells with a low surface area/cell volume ratio,demonstrate increased osmotic fragility; Cells with a high