1、Rb基因產(chǎn)物在大鼠肝細(xì)胞癌變過程中的異常表達(dá)及意義作者：韓克強(qiáng)，吳婭利，梁平，李靖，王細(xì)文，黃小兵【摘要】 目的 探討肝細(xì)胞癌變過程中Rb基因產(chǎn)物(Rb蛋白)的異常表達(dá)及其意義。方法 用0.2%二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)Wistar大鼠建立肝癌動物模型，應(yīng)用免疫組化法檢測Rb蛋白在大鼠肝臟癌變及轉(zhuǎn)移過程中的表達(dá)。結(jié)果 正常組20只中均見Rb蛋白表達(dá)，肝硬化組21只中有18只Rb蛋白過表達(dá)，肝癌組（未轉(zhuǎn)移）68只中有37只Rb蛋白過表達(dá)，肝癌組（伴轉(zhuǎn)移）18只中有3只Rb蛋白過表達(dá)。結(jié)論 Rb蛋白的陽性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，這輔證了Rb蛋白在肝細(xì)胞癌形成過程中發(fā)揮抑癌作用，Rb蛋白的

2、失活可能促進(jìn)肝癌形成，并與肝癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌 Rb基因 免疫組化 大鼠Abstract Objective To discuss the abnormal expression of retinoblastoma protein (Rb) gene product in the hepatocellular carcinogenesis and its significance.Methods 0.2% N-nitrosodethylamine (DEN) was applied to induce Wistar rats to form the model of

3、 hepatocellular carcinoma (HCC), and the expression of Rb protein in HCC carcinogenesis and metastasis was detected with immunohistochemical method.Results 20 rats in control group all showed the expression of Rb protein, 18 rats out of the 21 rats in liver cirrhosis group had the expression of Rb p

4、rotein as well as 37 rats out of the 68 rats in HCC (without metastasis) group, and only 3 rats out of the 18 rats in HCC (with metastasis) had the expression of Rb protein.Conclusions Uhe positive expression rate of Rb protein decreases gradually with the aggravation of lesion degree, which may ass

5、ist that Rb protein play an inhibiting role in hepatocellularcarcinoma, its inactivity may promote the genesis of HCC and is closely related to the progress and metastasis of HCC.KEYWORDS hepatocelluar carcinoma Rb gene immunohistochemistry rat近年來的研究表明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是癌變的重要原因。抑癌基因Rb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因)編碼的蛋白Rb是細(xì)胞周期重

6、要的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期G1到S期中主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用，以防止細(xì)胞增殖失控向腫瘤性增生轉(zhuǎn)化。已經(jīng)在人類多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Rb基因的突變或缺失，但其在肝細(xì)胞肝癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中的抑癌機(jī)制尚未完全闡明。為進(jìn)一步評價Rb蛋白在肝癌形成及發(fā)展中的作用，我們應(yīng)用二乙基亞硝胺(DEN)構(gòu)建了大鼠肝細(xì)胞癌模型，動態(tài)觀察肝細(xì)胞由正常、肝硬化、肝癌到轉(zhuǎn)移這個過程中Rb蛋白表達(dá)的變化，來驗證Rb蛋白與腫瘤的關(guān)系，從而為研究腫瘤的基因治療提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 實驗動物 實驗用清潔級雄性Wistar大鼠140只，910周齡，體重150g±20g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗

7、動物中心。1.1.2 試劑和儀器 二乙基亞硝胺(DEN) 購自美國Sigma公司，兔抗鼠免疫IgG(Rb蛋白)多克隆抗體多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、抗體稀釋液購自北京中山生物技術(shù)有限公司。IX70型相差倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。1.2 方法1.2.1 大鼠肝細(xì)胞癌模型的制備 實驗大鼠隨機(jī)分為對照組和實驗組，實驗組120只，對照組20只。實驗組參考文獻(xiàn)方法13，并改進(jìn)方法誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型，經(jīng)口咽插管至胃灌喂0.2%二乙基亞硝胺(DEN)溶液，每天1ml，每周連續(xù)灌喂5天，其余2天自由飲水，至第19周完后停止給藥，對照組以同樣

8、方法灌喂等量生理鹽水。于誘導(dǎo)第16、18、20、22、25周分批行MRI掃描后處死，并解剖觀察肝臟成瘤情況及有無轉(zhuǎn)移，對照組同時處死4只。取部分漂洗后肝臟放于10%中性福爾馬林固定，留做病理學(xué)檢查及免疫組化檢測，光鏡觀察肝臟病理變化，按大鼠肝腫瘤國際組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)判定4，并按分化程度分級。其余肝臟投入液氮備用。實驗過程中有41只大鼠死亡，對照組全部存活，實驗組累計檢測標(biāo)本107例。1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟切片按S-P試劑盒要求操作，經(jīng)脫蠟、脫水，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，進(jìn)行微波抗原修復(fù)。依次滴加正常山羊血清、一抗(1:200稀釋)、二抗、辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DA

9、B顯色后常規(guī)復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡觀察、拍照。以0.02M PBS代替一抗作陰性對照，以正常大鼠肝臟切片作陽性對照。1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 細(xì)胞染色陽性以細(xì)胞核或細(xì)胞漿著棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)，染色結(jié)果參照Mark Kelley實驗室標(biāo)準(zhǔn)5進(jìn)行腫瘤細(xì)胞陽性計分。首先在高倍鏡下計數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞，避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)域，根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目所占百分比得出細(xì)胞核或細(xì)胞漿標(biāo)記指數(shù)（Labeling index, LI），即細(xì)胞核或細(xì)胞漿LI陽性瘤細(xì)胞數(shù)/1000個腫瘤細(xì)胞×100%。分為以下四級計分：<10%記為0分，10%25%記為1分，25%50%記為2分，&

10、amp;gt;50%記為3分；染色強(qiáng)度按大多數(shù)腫瘤細(xì)胞著色的深淺計分：陰性記為0分，顯色為黃色（弱陽性）記為1分，顯色為棕黃色（中等陽性）記為2分，顯色為棕褐色（強(qiáng)陽性）記為3分。再將這兩項分值相加的總積分即為免疫組化的陽性分度：0分為陰性，記為(-)；12分為弱陽性，記為(+)；34分為陽性，記為(+)；56分為強(qiáng)陽性，記為(+)。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 免疫組化結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件2檢驗進(jìn)行分析。P<0.05或P<0.01表示差異顯著或非常顯著。2 結(jié)果2.1 肝細(xì)胞癌形成、發(fā)展過程中的病理變化 Wistar大鼠在誘導(dǎo)16周以前病理主要以肝硬化為主，并

11、出現(xiàn)4例肝細(xì)胞癌（高分化肝癌為主）。誘導(dǎo)第1722周以肝細(xì)胞癌為主，第23周及以后多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，腹腔內(nèi)可見腫大的淋巴結(jié)，可見肝內(nèi)、門脈、肺臟及腹腔等處轉(zhuǎn)移，部分有血性腹水。大鼠肝細(xì)胞癌（其中以梁索型和腺樣型居多）病理分級可分為高分化、中分化及低分化三級，本組例數(shù)分別為35、29、22例。對照組未發(fā)現(xiàn)異常病理改變。見表1。表1 肝細(xì)胞癌形成過程中的病變統(tǒng)計（略）2.2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá) 對照組20只均表達(dá)Rb蛋白。肝硬化組21只中有18只Rb蛋白過表達(dá)，陽性率為85.7%。肝癌組（未轉(zhuǎn)移）68只中有37只Rb蛋白過表達(dá)，陽性率為54.4%。肝癌組（伴轉(zhuǎn)移）18只中有3只Rb蛋白過表

12、達(dá)，陽性率為16.7%。肝硬化組和肝癌組的Rb蛋白表達(dá)均低于正常組，而肝癌組的Rb蛋白表達(dá)又低于肝硬化組，見表2。表2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)（略）四組間比較，234.416，P0.000 Rb蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，定位在細(xì)胞核。Rb蛋白在正常的肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而在肝硬化及腫瘤組織中Rb蛋白均有不同程度的失表達(dá)。在誘癌過程中，Rb蛋白的陽性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，四組間相差非常顯著(P<0.01)。其中肝硬化組表達(dá)稍低，與對照組無顯著差異(P>0.05)，而未轉(zhuǎn)移肝癌組與肝硬化組有非常顯著差異(P<0.01)，伴轉(zhuǎn)移肝癌組

13、中的表達(dá)率最低，與未轉(zhuǎn)移肝癌組相比差異非常顯著(P<0.01)。見表2、圖1、圖2。圖1 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)（略）圖2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)情況（IHC，SP法）（略）A：正常肝組織；B：肝硬化；C：肝癌(未轉(zhuǎn)移)；D：肝癌(伴轉(zhuǎn)移)3 討論 目前，人們對Rb基因及其表達(dá)產(chǎn)物Rb蛋白的了解日趨成熟。但做為與細(xì)胞周期相關(guān)的抑癌基因，其在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中的抑癌機(jī)制尚未完全闡明，Rb蛋白在HCC發(fā)病機(jī)制中與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系遠(yuǎn)未明確6。Rb基因廣泛存在于各組織中，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化，在去磷酸化狀態(tài)下作用于G1期，阻止G1期向S期轉(zhuǎn)化7,8。R

14、b基因編碼一個105Kda的功能性蛋白，位于細(xì)胞核內(nèi)，Rb蛋白是一個廣泛性的腫瘤抑制蛋白，其家族蛋白還包括p107、p130，有一個“口袋”結(jié)構(gòu)域，包含A和B兩個功能區(qū)，中間被一段間隔區(qū)隔開，它們相互作用，形成一個轉(zhuǎn)錄抑制基序9。Rb蛋白的磷酸化降解與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或預(yù)后相關(guān)10。 本研究結(jié)果顯示Rb蛋白在正常的肝細(xì)胞全部呈陽性表達(dá)，而在肝硬化及腫瘤組織中Rb蛋白均有不同程度的失表達(dá)，Rb蛋白的陽性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，四組間相差非常顯著(P<0.01)，這也輔證了Rb蛋白在肝細(xì)胞癌形成過程中可能發(fā)揮抑癌作用，Rb蛋白的失活可能促進(jìn)肝細(xì)胞癌形成、發(fā)生、發(fā)展。

15、Rb蛋白在伴轉(zhuǎn)移肝癌組、未轉(zhuǎn)移肝癌組和肝硬化組中的陽性表達(dá)率分別是16.7%(3/18)、54.4%(37/68) 和85.7%(18/21)，相差非常顯著(P<0.01)，這表明Rb蛋白的失活與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，支持Rb蛋白功能缺失主要出現(xiàn)于HCC進(jìn)展期。 值得注意的是，Rb蛋白在伴轉(zhuǎn)移肝癌組中的表達(dá)率為16.7%(3/18)，與未轉(zhuǎn)移肝癌組相比，有顯著差異(P<0.05)，這證實了其可能促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移和高侵襲性發(fā)展，Rb蛋白有可能成為肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測的參考指標(biāo)，至于Rb蛋白參與肝癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。相信隨著對Rb蛋白研究的深

16、入，必將揭開它在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，而且它也有望成為腫瘤生物治療的一個預(yù)后判斷的有價值的生物學(xué)指標(biāo)。【參考文獻(xiàn)】 Solt D, Farber E. New priciples for the analysis of chemical carcinogenesisJ. Nature, 1976, 263(5): 701703.2 Williams GM, Gebhardt R, Sirma H, et al. Non-linearity of neoplastic conversion induced in rat liver by low exposures to diethylnitro

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