1、Leptin對Leptin受體在GH3細胞中表達的影響 作者：劉亞莉，鐘延清，朱運龍，遲素敏 【關鍵詞】 瘦素；GH3細胞；leptin受體 【Abstract】 AIM: To observe the influence of leptin on the expression level of leptin receptors (OBR) in the cultured GH3 cells. METHODS: RTPCR method was used to observe the expression of leptin receptors (OBR) and its change in

2、GH3 cells. RESULTS: There were three subtypes of leptin receptors mRNA expressed in GH3 cells, including OBR (common form), OBRa (short form) and OBRb (long form). After leptin (10-8 mol/L) treatment for 48h, OBRa and OBRb mRNA levels in GH3 cells were increased to (154±11） and (188±9）. CO

3、NCLUSION: Leptin might regulate function of GH3 cells through leptin receptors in GH3 cells directly, including growth, proliferation and GH secretion of GH3 cells. 【Keywords】 Leptin；GH3 cell；leptin receptor 0引言 瘦素(Leptin)是由脂肪組織分泌的一種循環激素，具有多種生理功能，可調控能量代謝、攝食、機體脂肪的沉積以及神經內分泌和生殖功能. Leptin受體（leptin recep

4、tor, 也稱OB gene receptor, OBR）屬于細胞因子型受體，已發現至少有5種OBR的異型體，分別以a, b, c, d, e來命名. 根據細胞內位點的不同又把OBR分為長受體（OBRb）和短受體. 其中OBRb是長受體，也是主要的效應受體，含有一個由340個氨基酸組成的細胞內位點，這個細胞內位點被認為是Leptin信息傳遞的第一步；短受體包括OBRa，OBRc，OBRd和OBRe，具有信息轉運功能. 有研究顯示，Leptin受體在下丘腦、肺、腎、脈絡叢及生殖器官等多種組織中均有表達. Yonekura等1發現在牛和大鼠的垂體前葉有Leptin及Leptin 短型受體的表達.

5、在羊的下丘腦有Leptin受體的基因表達2，Leptin受體在人的正常垂體和垂體瘤中均有表達，但在不同種屬的不同部位OBR的表達形式不一3-4. 本研究旨在用RTPCR方法觀察Leptin受體3種亞型（OBR，OBRa以及OBRb）在大鼠GH3細胞中的表達，探討Leptin對大鼠GH3細胞中leptin受體表達的影響. 1材料和方法 1.1材料 GH3細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心); Leptin, 胰蛋白酶和EDTA(美國Sigma公司)；DMEM(美國Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；反轉錄試劑盒,PCR反應試劑盒(美國Promega公司)；Taq

6、 DNA聚合酶和DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)；瓊脂糖(洛陽華美生物工程公司). 所有引物均由大連寶生物工程有限公司合成. 1.2方法 1.2.1細胞培養大鼠生長激素瘤GH3細胞在含120 mL/L小牛血清DMEM培養液中常規培養、傳代，加入2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA (11)消化細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入含120 mL/L小牛血清的DMEM培養液，輕吹起細胞，調整細胞密度，以5×108/L的密度接種于96孔板，每孔100 mL，移入CO2孵箱，在37，50 mL/L CO2及飽和濕度條件下培養，24 h換液，之后每隔

7、48 h換液1次. 1.2.2逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR） 1.2.2.1細胞總RNA的提取GH3細胞以5×108/L的密度接種于直徑6 cm的培養皿中，移入CO2孵箱中培養，培養條件同上. 培養5 d后，收集細胞，用預冷滅菌的生理鹽水洗滌沉淀，將1 mL Trizol加到培養皿中，輕搖培養皿至液體浸潤到各處，待細胞懸浮后，將液體移入1.5 mL離心管中，冰上靜置5 min，加入200 mL氯仿，震蕩混勻，于室溫下靜置15 min，4，12 000 g離心15 min，小心吸取上層水樣（約300400 mL），轉入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，冰上沉淀10 min，4

8、，12 000 g離心10 min，RNA沉附于管底或管壁. 750 mL/L乙醇洗滌1次，4，7500 g離心10 min，去除乙醇液體，將RNA 沉淀風干，用20 mL無RNA酶水55溶解15 min，-20保存備用. 所有獲取的RNA 用分光光度計讀取A值，計算RNA的含量，并用A260 nm/A280 nm比值判斷RNA的純度. 1.2.2.2cDNA的合成以提取的總RNA為模板，cDNA合成反應體系為20 L，包括提取的總RNA 5 L，25 mol/L MgCl2 4 L，10×PCR緩沖液2 L，dNTP (10 mmol/L) 2 mL， RNA酶抑制劑0.5 L，A

9、MV反轉錄酶1 L，Oligo dT 1 L，其余用無RNA酶水補充至20 L，混勻后42水浴60 min，沸水浴5 min滅活反轉錄酶. 1.2.2.3PCR反應取合成的cDNA模板1 L，依次加入10×PCR緩沖液2.5 L，4×dNTP混合物1 L，Taq DNA聚合酶0.125 L，人OBR, OBRa和OBRb引物各0.5 L（OBR引物：sense：5CTCCGCACTCACAGGCAACA3, antisense：5TGGATCGGG CTTACAACAA3；OBRa引物：sense：5CCTATCGAGAAATATCAGTTTA3, antisense：5T

10、CAAAGA GTGTCCGCTCTCT3；OBRb引物：sense：5AGAATTGTTCCTGGGCACAAG3, antisense：5ACACTCAT CCTCACAGGTTCC3），加無菌去離子水補至25 L，首次循環94 4 min，然后94變性1 min，OBR 63退火1 min，OBRa 55退火1 min，OBRb 65退火1 min，72延伸1 min，末次循環72延伸6 min. 以不加入模板為陰性對照組，18 S為內對照（18 S引物：sense：5CGGCTACCACATCCAAGGAA3，antisense：5GCTGGAATT ACCGCGGCT3）. 取PCR

11、產物10 L，在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳以×174 DNA/Hae Marker為標準分子量，經凝膠圖像分析儀分析結果. 1.2.2.4半定量RTPCR將提取的細胞總RNA 取12 mL，初步進行紫外分析定量. 取5 mg RNA反轉錄成cDNA，以18 S為內對照進行PCR. 取各組細胞RTPCR產物10 mL，以×174 DNA/Hae Marker為標準分子量,在20 g/L瓊脂糖中進行凝膠電泳，電泳結果用UVP成像系統采集染色條帶后轉入計算機，并用圖像分析軟件分析各條帶密度. 將各產物的密度值與內對照18 S密度值進行比較得到其表達的相對值. 以對照組產物表達的相

12、對值為100%，其余各組表達的相對值與對照組相比較以計算其表達的變化率. 變化率(%)=(試驗組值/對照組值)×100%. 統計學處理: 所有數據均以x±Sx表示，組間均數比較用t檢驗處理，多組間均數比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義. 2結果 2.1OBR在大鼠GH3細胞的表達OBR，OBRa及OBRb的引物進行RTRCR后，產物經瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠圖像上可以看到，大鼠GH3 細胞有OBR, OBRa和OBRb的表達，3個條帶與預期片段大小相符（圖1）. 2.2Leptin可上調大鼠GH3細胞OBRa和OBRb mRNA的表達半定量RT

13、PCR實驗結果顯示，Leptin（10-8 mol/L）作用于體外培養的大鼠GH3 細胞48 h后其受體OBRa 和OBRb mRNA表達分別增加至（154±11）和（188±9），可顯著上調大鼠GH3細胞OBRa和OBRb mRNA的表達（圖2）. 3討論 1994年，Zhang等用定位克隆技術克隆了小鼠的肥胖基因(ob gene)及人類的同源序列，基因編碼產生由167個氨基酸殘基構成的蛋白質，N端有由21個氨基酸殘基構成的信號肽，信號肽切割后成為由146個氨基酸組成的成熟蛋白質，即為Leptin，是調節體重和攝食的一個重要因素5-6. Lin等4發現在豬的垂體前葉有長型

14、Leptin受體的表達，在人垂體中也有OBRb mRNA的表達. 免疫組織化學雙染色顯示在大鼠垂體前葉有OBR和垂體激素表達的雙重定位7，表明主要屬生長激素（GH）分泌細胞(97.4±1.3)%（GH陽性細胞/OBR陽性細胞），而催乳素分泌細胞、促腎上腺皮質激素、促甲狀腺激素和促甲狀腺激素/黃體生成素陽性細胞不到1%. GH不僅參與機體的生長發育，通過影響能量代謝對機體組成和脂肪分布也起著一定作用，有關Leptin對GH影響的研究越來越多的被人們關注. 我們的實驗結果顯示，在大鼠GH3細胞上有OBR的表達，包括其長型(OBRb),短型(OBRa)和通用型(OBR)受體mRNA的表達，

15、提示Leptin可能通過其在GH3細胞上的相應受體直接調控GH3細胞的功能，影響GH3細胞的生長和GH的分泌. 很多生理性或病理性因素能影響受體的親和性、受體數量、膜受體傳遞信息的能力和激素作用的受體后環節，這些調節可以造成激素反應的脫敏或超敏現象. 對許多內分泌細胞來說，激素與受體的結合增加了受體進入細胞內的速度，因此，增加細胞內和被分解的受體數量，加快受體分解，最終導致細胞表面受體數量的減少，這是一種負反饋調節. 雖然大多數激素誘導其受體下調，但也有一些激素如催乳素，起到正向同源性調節作用. 例如，用催乳素刺激肝細胞能增加催乳素受體合成及受體數量，加強細胞對這個激素的反應. 除了直接調節受

16、體，激素與受體的結合還能引起其他形式的調節，它可以發生在受體水平、 受體后水平或兩者皆有. 半定量RTPCR實驗結果發現Leptin可上調大鼠GH3細胞中Leptin受體基因的表達，增加OBRa和OBRb mRNA的含量，該作用與通常的激素對其受體的反饋性下調不一致，有可能對其受體起到正向同源性調節作用，考慮這可能與Leptin抵抗有關系. 肥胖患者的血清Leptin水平很高，但因Leptin抵抗無法實現其調控能量代謝和體質量的作用，那么Leptin受體的上調是否與肥胖患者發生leptin抵抗有關？這一結果為肥胖的研究提供了一個新思路，對于研究肥胖及其相關疾病有一定意義. 但是另一方面轉錄后還

17、要經過修飾、加工和翻譯過程，Leptin對GH3細胞Leptin受體蛋白水平的影響我們并未檢測，雖然其mRNA水平上調，但其轉錄后的翻譯、修飾等過程最終形成有功能的能結合leptin 并將信號傳入細胞內的受體蛋白量的變化尚不清楚，其受體蛋白水平有可能會升高或降低. 關于受體蛋白水平的變化有待進一步的檢測. 【參考文獻】 1Yonekura S, Senoo T, Kobayashi Y, et al. Effects of acetate and butyrate on the expression of leptin and shortform leptin receptor in bovi

18、ne and rat anterior pituitary cellsJ. Gen Comp Endocrinol, 2003, 133(2):165-172. 2Adam CL, Archer ZA, Findlay PA, et al. Hypothalamic gene expression in sheep for cocaine and amphetamineregulated transcript, proopiomelanocortin, neuropeptide Y, agoutirelated peptide and leptin receptor and responses

19、 to negative energy balanceJ. Neuroendocrinology, 2002, 75(4):250-256. 3Jin L, Burguera BG, Couce ME, et al. Leptin and leptin receptor expression in normal and neoplastic human pituitary evidence of a regulatory role for leptin on pituitary cell proliferationJ. J Clin Endocrinol Metab, 1999, 84:2903-2911. 4Lin J, Barb CR, Kraeling RR, et al. Growth hormone