1、惡臭假單胞菌TS1138轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-胱氨酸的工藝研究劉春琴1 余養(yǎng)盛1 白 鋼1* 楊文博1 陳 寧2 懷立華2(1. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津 300071)(2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津 300222)摘 要: 對(duì)以DL-2-氨基-2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)為底物原料, 經(jīng)微生物酶法催化合成L-半胱氨酸, 并進(jìn)一步氧化和分離純化產(chǎn)物L(fēng)-胱氨酸的生產(chǎn)工藝和條件進(jìn)行了研究。建立了以惡臭假單胞菌TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全細(xì)胞為酶源, 反復(fù)多次催化底

2、物合成L-半胱氨酸, 并以2.0%二甲基亞砜(DMSO)為氧化劑氧化生成L-胱氨酸, 進(jìn)而通過001×7型陽(yáng)離子交換樹脂純化胱氨酸的新工藝。采用高效液相色譜法考察該方法L-胱氨酸的總收率可以達(dá)到78.55%, 純度為99.12%。該方法簡(jiǎn)單高效, 解決了酶穩(wěn)定性差不能重復(fù)使用, 而固定化酶方法繁瑣成本高的問題, 為我國(guó)L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生產(chǎn)開辟一條新途徑。關(guān)鍵詞: 惡臭假單胞菌, DL-ATC, L-半胱氨酸, L-胱氨酸, 生產(chǎn)工藝Study on L-cystine Conversion Technology by Pseudomonasputida TS1138LIU

3、Chun-Qin1 YU Yang-Sheng1 BAI Gang1* YANG Wen-Bo1CHEN Ning2 HUAI Li-Hua2(1. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)(2. Bioengineering College, TianJin University of Science and Technology, Tianjin 300222)Abstract: A technology of L-cystine production was studied in this paper, wh

4、ich included microbial enzymatic conversion of DL-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic acid (DL-ATC) to L-cysteine, subsequent oxidization of L-cysteine to L-cystine and its purification. The cells of Pseudomonas putida TS1138 could be repetitively used as the enzyme sources to convert the substrate DL

5、-ATC to L-cysteine. After being oxidated by 2% dimethy-sulforide (DMSO), L-cystine could be harvested and further purified by the positive ion-exchange resin 001×7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) identified the purified L-cystine as having a total recovery of 78.55% and purity of

6、 99.12%. This study demonstrated an efficient and convenient method for L-cystine production, which overcame the instability of enzymes, troublesome procedures and high cost of enzyme immobilization as contrasted to the traditional method. All in all, it provides a new approach for industrial produc

7、tion of L-cystine as well as L-cysteine.Keywords: Pseudomonas putida, DL-ATC, L-cysteine, L-cystine, Production processL-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸, 廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè)1。目前, 工業(yè)上主要通過毛發(fā)酸水解生產(chǎn)L-半胱氨酸。該工藝生產(chǎn)率低, 且產(chǎn)生大量刺激性氣體和廢酸造成環(huán)境污染2。另外, 由毛發(fā)水解法或其它方法獲得的含半胱氨酸反應(yīng)液, 由于其組成復(fù)雜3, 并且半胱氨酸在水中的溶解度較高4, 所以要從復(fù)雜的反應(yīng)液中分離出高純度的半胱氨酸是困難的。但半

8、胱氨酸易被氧化成胱氨酸, 而胱氨酸在水中的溶解度極低4, 通常利用這一特性可將反應(yīng)液中的半胱氨酸首先轉(zhuǎn)化成胱氨酸, 沉淀析出, 然后再將分離出的胱氨酸電解還原成半胱氨酸5, 從而可獲得半胱氨酸純品。自Sano1,6等發(fā)現(xiàn)嗜硫氮雜環(huán)戊烯假單胞菌(Pseudomonas thiozolinophilum)能夠把DL-2-氨基- 2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-Amino-2-thiazoline-4-carboxylic Acid, DL-ATC)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸, 利用微生物酶法生產(chǎn)半胱氨酸已成為人們研究和關(guān)注的方向7。本實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得一株惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida

9、)TS1138, 并發(fā)現(xiàn)其具有轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的能力8。本研究對(duì)TS1138菌株轉(zhuǎn)化生成的半胱氨酸后的氧化條件、分離純化、產(chǎn)物鑒定以及酶源細(xì)胞的重復(fù)利用等方面進(jìn)行了初步研究, 為微生物酶法制取L-胱氨酸和L-半胱氨酸的生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌種: 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) TS1138, 本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得8。1.1.2 培養(yǎng)基9: 種子培養(yǎng)基: 葡萄糖20 g, ATC 3 g, 玉米漿5 g, 尿素3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4·H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO4&#

10、183; 7H2O 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01 g, 定容至1 L, pH 7.5; 產(chǎn)酶培養(yǎng)基: 葡萄糖30 g, ATC 4 g, 玉米漿1 g, 尿素3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4·H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01 g, 定容至1 L, pH 7.5。1.1.3 主要試劑和儀器: L-半胱氨酸和L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品; DL-ATC購(gòu)自天津試劑二廠; 高效液相所用試劑為色譜純, 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。發(fā)酵使用上海保興

11、的BIOTECH- 10BGZ型發(fā)酵罐; DL-ATC和L-胱氨酸的含量檢測(cè)采用島津LC-10AT高效液相色譜儀和Model 200S ELSD 蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器; 旋光度檢測(cè)使用上海物理光學(xué)儀器廠WZZ-2A型自動(dòng)旋光儀。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 酶源細(xì)胞的獲得: 從平板上挑取一環(huán)惡臭假單胞菌TS1138接入種子培養(yǎng)基中, 28 200 r/min培養(yǎng)16 h后, 以1%接種量轉(zhuǎn)接到7 L產(chǎn)酶培養(yǎng)基中, 在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng), 發(fā)酵條件如下: 溫度: 29; pH: 6.46.7; 轉(zhuǎn)速: 400 r/min; 通氣量: 200 L/h。發(fā)酵16 h, 發(fā)酵液于4下6 000

12、×g離心10 min, 棄去上清液, 菌體用PBS緩沖液(0.02 mol/L磷酸緩沖液, 0.15 mol/L NaCl, pH 7.4)懸浮洗滌, 4, 8000 ×g 離心10 min, 重復(fù)洗滌2次, 收集菌體稱取濕重, 并加入PBS制得終濃度為25%(W/V)的酶源細(xì)胞菌懸液。1.2.2 DL-ATC轉(zhuǎn)化反應(yīng): 150 mL酶源細(xì)胞懸液中加入300 mL底物溶液(0.6% DL-ATC, 0.6% K2HPO4, 0.01%羥胺, pH 7.58.0), 混勻后置于42 恒溫水浴中反應(yīng)2.5 h。轉(zhuǎn)化后離心分離酶源細(xì)胞及反應(yīng)液, 酶源細(xì)胞經(jīng)PBS重懸后用于下一次轉(zhuǎn)

13、化反應(yīng), L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化液可用于進(jìn)一步的氧化實(shí)驗(yàn)。1.2.3 L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量測(cè)定: 采用Gaitonde法直接測(cè)定溶液中L-半胱氨酸的含量10。再將溶液適當(dāng)稀釋后與等體積的2 mmol/L 1,4-二硫蘇糖醇(DTT)溶液混合, 經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)pH值8.0至8.5, 室溫下靜置1h, 使溶液中的L-胱氨酸完全還原成L-半胱氨酸后再采用Gaitonde法測(cè)定其中L-半胱氨酸的含量, 兩者之差即為L(zhǎng)-胱氨酸的含量。1.2.4 DL-ATC和L-胱氨酸的高效液相色譜法檢測(cè): 色譜柱: Nucleosil SA(250×4.6 mm), 進(jìn)樣體積: 20 mL。流動(dòng)相:

14、冰乙酸-三乙胺-水(0.1: 0.1: 99.8); 流速: 0.6 mL/min; 柱溫: 25 。ELSD檢測(cè)器參數(shù): 漂移管溫度40; 氮?dú)鈮毫? 2.8 Bar。1.2.5 L-胱氨酸的分離純化: 取經(jīng)DMSO 氧化后的L-胱氨酸反應(yīng)液, 上樣于001×7型陽(yáng)離子樹脂柱(40 cm × 2.6 cm), 流速1.5 mL/min。充分洗滌后以 1.0 mol/L氨水洗脫, 洗脫速度0.7 mL/min。收集洗脫液, 并以上述1.2.3方法檢測(cè)洗脫液中L-胱氨酸的含量。合并活性洗脫峰, 以HCl調(diào)pH值至5.0, 析出胱氨酸白色粉末。過濾收集上述粉末, 經(jīng)少量無水乙醇

15、洗滌, 烘干后進(jìn)行純度鑒定。1.2.6 胱氨酸的旋光性鑒定: 分別稱取分離純化后的粉末和標(biāo)準(zhǔn)品各0.121 g, 溶解于5 mol/L、12 mL的鹽酸中, 將溶液裝入旋光儀的盛液管中, 進(jìn)行旋光性測(cè)定, 計(jì)算其比旋光度。 2 結(jié)果與分析2.1 微生物酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC生成L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化效率采用微生物酶法單次轉(zhuǎn)化DL-ATC后, 離心取上清液, 以Gaitonde法測(cè)得溶液中L-半胱氨酸濃度為 3.21 g/L (摩爾濃度0.027 mol/L), 經(jīng)計(jì)算從底物DL-ATC到產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到了96.83%。2.2 L-半胱氨酸氧化條件的考察2.2.1 氧化劑的考察: 取一

16、定量的上述轉(zhuǎn)化液, 分別加入不同劑量的DMSO或H2O2, 用HCl調(diào)節(jié)pH為1.0, 室溫氧化8 h后, 再分別測(cè)定L-半胱氨酸氧化率及L-胱氨酸生成率。如圖1所示, 當(dāng)DMSO的濃度在2%, L-半胱氨酸的氧化率均可以達(dá)到97.4%, 而L-胱氨酸的生成率可以達(dá)到91.6%。而H2O2 為強(qiáng)氧化劑, 當(dāng)濃度在1%以上時(shí)L-半胱氨酸的氧化率均可以接近99%, 但所得到的胱氨酸會(huì)被進(jìn)一步氧化為磺基丙氨酸11, 從而導(dǎo)致胱氨酸生成率幾乎為零。圖1 L-半胱氨酸氧化劑的考察Fig. 1 Test of oxidizing agents for L-cysteine以DMSO為氧化劑時(shí)L-半胱氨酸的

17、氧化率()和L-胱氨酸的生成率(); 以H2O2為氧化劑時(shí)L-半胱氨酸的氧化率()和 L-胱氨酸的生成率()Oxidization rate of L-cysteine () and generation rate of L-cystine () using DMSO as the oxidizing agent; Oxidization rate of L-cysteine () and generation rate of L-cystine () using H2O2 as the oxidizing agent.2.2.2 DMSO氧化時(shí)間及氧化劑量的考察: 取一定量轉(zhuǎn)化反應(yīng)上清液,

18、分別加入終濃度為1%、2%和3%的DMSO, 調(diào)節(jié)pH為1.0, 室溫氧化212 h后, 分別測(cè)定L-半胱氨酸氧化率及L-胱氨酸得率。結(jié)果如表1所示, 氧化時(shí)間超過8 h以后, L-半胱氨酸的氧化率及L-胱氨酸生成率均沒有明顯提高。而在26 h內(nèi), 3.0%DMSO的氧化率明顯高于2.0% DMSO, 但隨著時(shí)間延長(zhǎng), 高濃度的氧化優(yōu)勢(shì)逐漸失去, 原因可能與過量的DMSO也可將L-胱氨酸進(jìn)一步氧化有關(guān)11。表1 DMSO氧化時(shí)間及氧化劑量的考察Table 1 Test of oxidizing time and concentration of DMSOCD(V/V)OR/GR()Time2h

19、4h6h8h10h12h1.0%OR64.772.178.381.282.483.5GR58.669.374.576.777.678.22.0%OR69.479.787.196.797.897.5GR64.574.380.690.991.490.23.0%OR76.587.294.296.897.796.4GR73.278.983.485.987.186.3CD: Concentration of DMSO; OR: Oxidization rate of L-cysteine; GR:Generation rate of L-cystine2.3 酶源細(xì)胞的重復(fù)利用次數(shù)的考察由于假單胞菌TS

20、1138中存在L-半胱氨酸脫巰基酶可分解L-半胱氨酸為丙酮酸12, 直接影響其產(chǎn)率, 所以在轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后需要盡快分離酶源細(xì)胞和產(chǎn)物的L-半胱氨酸, 所回收的酶源細(xì)胞又可以重復(fù)用于下一次的轉(zhuǎn)化和氧化實(shí)驗(yàn)。酶源細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示, 前6次L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率與L-胱氨酸的生成率均可以在95和80以上, 第7次后則迅速下降, 證明同一批酶源細(xì)胞至少可以重復(fù)利用5次。圖2 酶源細(xì)胞重復(fù)利用次數(shù)的考察Fig. 2 Test of the repetitive use times of enzyme source cellsL-半胱氨酸的生成率(); L-胱氨酸的生成率()Generation

21、 rate of L-cysteine(); generation rate of L-cystine().2.4 氧化產(chǎn)物的分離純化收集上述含有L-胱氨酸的轉(zhuǎn)化液(約2.7L), 經(jīng)001×7型陽(yáng)離子樹脂柱吸附, 氨水洗脫, 收集No. 6-10洗脫峰, 經(jīng)HCl沉淀、洗滌、烘干后最終得到7.031g L-胱氨酸白色粉末, 收率為DL-ATC轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸最大理論收率的78.55% (圖3)。圖3 001×7型陽(yáng)離子樹脂分離L-胱氨酸的洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of L-cystine isolated by 001×7 ion exc

22、hange resin取一定量上述條件所制備的L-胱氨酸粉末溶于HCl后, 采用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè), 與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)其純度達(dá)到99.12%(圖4)。圖4 HPLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)化液及純化后的L-胱氨酸含量Fig. 4 Concentration of L-cystine by HPLC test in the conversion solution and after purificationA: DL-ATC和L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn); B: TS1138轉(zhuǎn)化液; C: 純化后L-胱氨酸。色譜峰分別為, 1: L-胱氨酸(保留時(shí)間5.371 min), 2: DL-ATC(保留時(shí)間6.285 min)A:

23、DL-ATC and L-cystine standards; B: conversion solution of TS1138; C: purified L-cystine. chromatographic peaks: 1: L-cysine (retention time: 5.371 min); 2: DL-ATC (retention time: 6.285 min)2.5 胱氨酸的旋光性鑒定純化后的產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)的L-胱氨酸的比旋光度aD分別為-226.4、-229.7, 且與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致13, 因此可以確證得到的為L(zhǎng)型胱氨酸。3 討論2002年Shiba等報(bào)道了假單胞菌BS菌株由

24、DL-ATC經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化生成L-半胱氨酸是通過L-ATC水解酶水解ATC噻唑環(huán)中C2-S單鍵, 以N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)為轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物, 再經(jīng)N-氨甲酰-L-半胱氨酸氨甲酰水解酶催化生成L-半胱氨酸的N-代途徑(L-NCC途徑)14。利用自行分離的惡臭假單胞菌TS1138, 我們已經(jīng)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的酶學(xué)性質(zhì)和功能基因研究 9, 并證明其能通過L-ATC水解酶水解ATC噻唑環(huán)中的C=N雙鍵, 生成S-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-SCC)中間產(chǎn)物, 再經(jīng)S-氨甲酰- L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-SCC酰胺水解酶)催化生成終產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸, 為不同于N-代途徑的S-代途徑, 在轉(zhuǎn)化機(jī)

25、理的研究上取得了一定的進(jìn)展15。在此基礎(chǔ)上, 本研究對(duì)以DL-ATC為出發(fā)原料最終制備L-胱氨酸的工藝條件進(jìn)行了研究, 建立了以假單胞菌TS1138全細(xì)胞為酶源, 微生物酶法多次催化DL-ATC合成L-半胱氨酸, 并采用DMSO氧化水溶液中的半胱氨酸成胱氨酸, 進(jìn)一步通過陽(yáng)離子交換樹脂分離純化L-胱氨酸的生產(chǎn)工藝, 其收率達(dá)到78.55%, 純度達(dá)到99.12%。通常在由酶催化法進(jìn)行的反應(yīng)中, 酶穩(wěn)定性差、易失活, 一般不能重復(fù)使用, 而固定化的方法又或多或少對(duì)酶活力有一定影響。本方法簡(jiǎn)單高效, 有望為我國(guó)L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生產(chǎn)開辟一條新途徑。參 考 文 獻(xiàn)1 Sano K, Yoko

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