1、化學分析計量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第22卷,第3期2013年5月V ol. 22,No. 3May 2013100黃曲霉毒素檢測方法研究進展黃潔(中國人民解放軍總后勤部司令部管理保障局第二門診部,北京100071摘要對黃曲霉毒素的檢測方法薄層色譜、高效液相色譜、免疫學與儀器聯用、超光譜等分析方法進行了綜述,評述了上述方法的優劣、適用條件和最新進展。關鍵詞黃曲霉毒素;檢測方法;超光譜法;研究進展中圖分類號:O656.3 文獻標識碼:A 文章編號:10086145(201303010005Research Progress in Detecting Metho

2、ds of A atoxinsHuang Jie(No.2 Clinic, Management Support Bureau, General Logistics Department, Beijing 100071, ChinaAbstract Aflatoxin detecting methods were reviewed such as TCL, HPLC, immunology and instrumentation association, hyperspectral detection methods, the pros and cons of the above method

3、s, the applicable conditions and the latest progress were reviewed.Keywords a atoxins; detecting methods; hyperspectral detection methods; research progress 在當今社會,食品安全越來越受到人們的關注和重視,尤其是在發生三聚氰胺和地溝油等一系列事件之后,人們更加重視食品安全問題。黃曲霉毒素這類真菌在世界不同地區都發現大量存在于食品中,它主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類有毒次生代謝物12。目前已知的黃曲霉毒素及其衍生物有20余種,即B1

4、,B2,B2a ,G1,G2,G2a ,M1,M2等,黃曲霉毒素B1是其中毒性最大的一種,實驗結果顯示,其毒性是人們熟知的劇毒藥氰化鉀的10倍,是砒霜的68倍。黃曲霉毒素B1可誘發癌癥和皮下肉瘤,并且可使動物的肝、腎、大腦和神經系統等產生病變。自20世紀60年代以來,有關黃曲霉毒素的危害被大量報道,以致黃曲霉毒素已成為最受人們關注的一種真菌毒素3。因此,尋求準確、快速、簡便、價廉的檢測方法,對黃曲霉毒素進行高效的定性定量分析,是黃曲霉毒素研究的一個重要方面。以下對黃曲霉毒素的檢測方法研究進展進行評述。1薄層色譜法1.1薄層層析(TLC 法TLC 法是測定黃曲霉毒素的經典方法,在薄層板展開后,在

5、365 nm 紫外燈下,黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2分別顯示紫色、藍紫色、綠色和綠色熒光。TLC 法的特異性較差,靈敏度相對較差,且測定黃曲霉毒素專一性不夠,經常引起測量誤差。但由于此法設備簡單,易于普及,所以國內外仍在使用。1.2高效薄層(HPTLC 法HPTLC 法45測定黃曲霉毒素采用目前國際上流行的樣品處理方法固相萃取法(SPE 中針對真菌和病毒的多功能凈化(MFC 柱。采用MFC 柱凈化后,僅用單相展開即可達到分離測定的目的,不僅節省了工作時間,提高了工作效率,而且進一步減少了有毒有害溶劑的用量。Stroka 等6將免疫親合柱凈化應用于TLC 法測定,進行單相展開并用熒光密度計定

6、量,此方法能檢測含量明顯低于當前歐盟標準的黃曲霉毒素。Kamimura 等7用HPTLC 方法測定玉米、花生、蕎麥等樣品,并與通過公職分析化學家協會(AOAC 認證的分析花生及花生制品中黃曲霉素的官方方法CB (Contamination Branch 法和BF (Best Foods 法進行比較,4種主要黃曲霉毒素的檢測限均不高于0.2 g /kg ,回收率與CB 法一樣均高于BF 法。1.3高壓薄層色譜(OPTLC 法高壓薄層色譜于1979年由Tyihak 提出8,它結合了經典薄層色譜法、高效薄層色譜法與高效液相色譜法的優點,是一種能夠提高薄層分離效率的平面液相色譜技術。隨著實驗技術的不斷

7、成熟,OPTLC 法在飼料和食物中黃曲霉毒素的檢測方面的應用越來越多。Eszter Papp 等9發展了一系列適合檢測玉米和小麥中黃曲霉毒素的OPTLC 方法。2高效液相色譜(HPLC 法由于具有穩定、準確、靈敏等優點,HPLC 法已成為當前進行黃曲霉毒素定量研究的首選方法。分析黃曲霉毒素的液相色譜方法包括正相液相色譜方聯系人:黃潔;E-mail: hjeileen 收稿日期:20130329101黃潔:黃曲霉毒素檢測方法研究進展法(NPLC和反相液相色譜方法(RPLC。反相高效液相色譜(RP-HPLC系統易操作,流動相具有低毒性,可同時分離、分析樣品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2且不受樣

8、品沸點、熱穩定性、和分子量限制,所以目前使用熒光檢測器的反相HPLC法已經成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法10。Chiavaro等11根據不同環式糊精增強黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1熒光釋放的不同效果,發展了將環式糊精加入到流動相中的高效液相色譜法,黃曲霉毒素B1,B2,G1, G2的檢測限均在0.3 g/kg以下,M1 的檢測限在0.000 5 g/kg以下,幾種黃曲霉毒素都呈線性反應關系。這種方法也被用于測定自然污染及人工添加樣品。3免疫學方法黃曲霉毒素的免疫學檢測方法是將生物大分子的免疫學特性與化學特性結合起來的檢測方法。該方法具有快速、靈敏、對樣品純度要求不高的特點,特別適合

9、于大批量樣本的檢測。用于檢測黃曲霉毒素的免疫學方法有酶聯免疫吸附測定法、放射免疫測定法、親和層析法、熒光偏振免疫測定法及免疫層析法。3.1酶聯免疫吸附測定(ELISA法ELISA法是在免疫學和細胞工程學基礎上發展出來的一種微量檢測技術,分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法,其優點是對黃曲霉毒素B1的檢測定性定量準確而且檢測速度快(比薄層法提高了近200倍12,特異性強,熒光物質、色素、結構類似物對結果無干擾,回收率高,提取方法簡單,成本較低,特別適合于對黃曲霉毒素Bl污染監測控制中大量樣品的篩查1314。缺點是ELISA法中酶的活性易受反應條件影響,測定結果重復性較差,測定結果易出現假陽性

10、問題;此外ELISA試劑壽命短,需要低溫保存,葡萄酒類、含鹽量高的醬油、含脂量高的花生油在提取時要進行調節pH值、脫鹽、脫脂等特殊處理。3.2親和層析法親和層析法利用免疫化學反應原理,采用大劑量的單克隆抗體,選擇性吸附提取液中的抗原物質黃曲霉毒素。由于抗原抗體反應具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點,從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測靈敏度,同時可顯著減少有毒有害試劑的使用,有利于操作人員的身體健康和環境保護。3.3放射免疫(RIA法RIA法與ELISA法基本相似,不同的是它們所使用的標記物不同,ELISA法的標記物為酶,RIA法所用的標記物一般為放射性元素氚(3H。該方法是將毒素3H標記物與樣

11、品加抗體進行競爭性結合,除去未結合的部分,測定其放射性,放射性強則說明樣品中毒素含量低,反之毒素含量高15。實驗證明ELISA比RIA靈敏度更高且更簡便,并且RIA需要特殊設備,有放射性元素污染問題,人員需要安全防護,現在已經很少使用。3.4熒光偏振免疫測定法熒光偏振免疫測定法的主要原理是熒光標記的毒素在樣品緩沖液中與未熒光標記的毒素對特異性抗體的競爭性結合。分子質量越大,分子旋轉速度越慢,熒光偏振值越大。Nasir等16報道了用基于熒光偏振的裝置檢測不同谷物中的黃曲霉毒素。3.5免疫層析(IC法IC法是20世紀80年代初發展起來的一種快速免疫分析技術,其操作簡單,快速,人員不用培訓,且不需特

12、殊的儀器設備,非常適用于現場測試和進行大量樣品的初篩17。4免疫學與儀器結合方法近年來,隨著黃曲霉毒素在食品中的檢出標準越來越嚴格,很多人采取了免疫學與儀器結合的方法來檢測黃曲霉毒素,發展了黃曲霉毒素的檢測方法。4.1免疫親和柱凈化熒光光度法張藝兵等18提出了一種以免疫親和柱凈化結合熒光光度法檢測黃曲霉毒素的新方法,此法利用抗原抗體對應的特異吸附特性,以黃曲霉毒素單克隆抗體為填充柱,特異性、選擇性地吸附黃曲霉毒素,再以甲醇為流動相將結合的黃曲霉毒素洗脫下來然后通過溴溶液衍生,所得衍生物可發射熒光,再通過熒光光度計分析即可以測定毒素含量。此方法克服了TLC法和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌

13、毒素作為標定標準物和在樣品預處理過程中使用多種有毒、有異味的有機溶劑對操作人員造成身體傷害和污染環境的缺點,所需儀器設備輕便易攜帶,自動化程度高,操作簡單,靈敏度可達1 g/kg,回收率在85%以上。一個樣品只需1015 min便能直接讀出測試結果,比傳統方法快幾個小時甚至幾天時間。缺點是此法只能測定黃曲霉毒素的總量且對試劑要求比較高,檢測中藥材黃曲霉毒素的含量時結果會出現一些假陽性。4.2免疫親和柱高效液相色譜法免疫親和柱(IAC是將特異性的黃曲霉毒素單克隆抗體與載體蛋白偶聯并填柱而成。由于抗原抗體有一一對應的特異性吸附關系,所以IAC能特效性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素,而讓其它雜質通過柱

14、子,使樣品得以純化,吸附的黃曲霉毒素可以被極性有機溶劑洗脫,再用HPLC法進行定量檢測19,其優點是具有高度特異性,可除去絕大多數干擾物質,檢測限達1 ng/g,還具有快速、溶劑使用少、可以自動化和再生利用的特點。缺點是柱成本高,商品化IAC僅適合幾種毒素,有時需要加預柱凈化。化學分析計量 2013年,第22卷,第3期1024.3多功能凈化柱高效液相色譜法Wilson和Romer20開發了獨特的真菌毒素多功能凈化(MFC柱,MFC柱提供一種快速的一步萃取純化方法,工作原理和操作過程與其它凈化柱相反,它含有親脂性(非極性和電荷活性成分(極性,當樣品提取液通過柱時,MFC 柱保留樣品液中的干擾物質

15、如脂肪、蛋白質類化合物和碳水化合物等,而待測組分黃曲霉毒素不被吸附而直接通過,從而一步完成凈化過程,除去90%的雜質,減少了傳統凈化方式淋洗雜質和洗脫待測樣品的步驟,從而達到凈化目的,這一點是IAC和普通SPE凈化柱所不具備的,并且與IAC相比凈化效果同樣理想,回收率高,靈敏度高,檢測限低。5超光譜(HS法一直以來,黃曲霉毒素的檢測都用化學方法,并且有些化學方法的檢測結果非常準確,但是化學方法都要耗費大量的檢測時間,檢測費用較高且損壞檢測樣品,所以研究一種快速、準確、無損樣品的檢測方法對糧食產業是至關重要的,超光譜法檢測黃曲霉毒就是這樣一種方法。它的原理是首先通過光源激發待測樣品,再通過設備捕

16、捉成像,然后對成像進行特征抽取和特征排列,最后實現區別受黃曲霉毒素污染和未受黃曲霉毒素污染的樣品。Haibo Yao21等利用超光譜法分析了長波紫外線激發下的玉米粒的光譜BGYF響應,首先用中心激發波長為365 nm的紫外線光照射檢測樣品,被檢測到黃綠色熒光的玉米粒,手動挑選出來,結果顯示,在500515 nm波長范圍具有較強的黃綠色熒光發射光譜峰,選取500515 nm有較強黃綠色熒光的玉米粒作為陽性組,用高效液相色譜法測定,與正常組對比,呈黃綠色熒光成像的黃曲霉毒素濃度的平均水平濃度是5.114 g/g。這個實驗證明了玉米只有在感染黃曲霉毒素多的時候才會發出黃綠色熒光,所以根據BGYF測量

17、黃曲霉毒素的含量是不準確的。Haibo Yao等22還發現感染黃曲霉毒素的玉米會發生峰偏移現象,受黃曲霉毒素感染高的玉米粒其光譜峰會向長波方向移動,未受感染或者感染率低的玉米粒光譜峰會向短波方向移動,并且受黃曲霉毒素感染高的玉米粒比未受感染的玉米粒光譜峰強度低。使用超光譜法和光譜角度映射分類法對樣品測試,樣品熒光強度不敏感但對峰的變化敏感23,對待測玉米以20,100 ng/g為臨界值做檢測,分類精度為86%時有15%的假陽性率,88%時有16%的假陽性率,結果表明,超光譜法和光譜角度映射分類法可以對感染與非感染玉米進行分類。Haibo Yao等24用中心波長為365 nm的紫外光激發待測玉米

18、,用最大相似率和二進制編碼兩種算法分別對臨界值為20,100 ng/g進行實驗,并與HPLC檢測結果進行對比,發現二進制編碼比最大相似率分類精確,20 ng/g和100 ng/g的分類精度分別為87%, 88%。Pearson等25發現在BGYF光很弱的時候利用該檢測系統無法檢測到BGYF。他用一個硅光電二極管光纖光譜儀通過辨別分析,利用光的反射比從含量小于10 ng/g或者沒有被污染的玉米中檢測出受黃曲霉毒素污染大于100 ng/g的玉米,分類精度達到96.6%。Kalkan等26在365 nm的紫外燈下分析了285個榛子樣品,在440450 nm該鑒別能力最強的譜帶分類精度達到90%。Mu

19、sa Ata等27用超光譜法對紅辣椒進行實驗,選擇鹵素燈和紫外光兩種光源進行對比,在對成像進行特征抽取時分為單獨頻帶能量特征和連續絕對差異光譜波段能量兩種,在成像的特征排列中用了最低冗余和最大相關性(mRMR及多層感知器連接權重(MLP,并對單獨頻帶能量特征和連續差異光譜波段能量使用了量子直方圖矩陣方法,并與HPLC檢測結果做了對比,最終實驗結果表明光源采用鹵素燈、特征排列方法采用MLP法的分類精度最高(達91%。Haibo Yao等28研究了窄頻帶光譜指數加速檢測黃曲霉毒素的方法,原先因為受到發射響應的限制,成像的強度位準比較低,全部的檢測結果持續時間很長,而窄頻帶光譜可以使這種情況得到改善

20、。首先用歸一化差異熒光指數(NDFI、差異化指數(DFI、熒光率指數(FRI3個指數與多譜線成像系統進行比較,發現兩個系統的NDFI指數有最好的相關性,然后用窄頻帶光譜對25 g和1 kg的樣品分別做了臨界值為20,100 ng/g的實驗,并與HPLC進行比較。25 g樣品20,100 ng/g的分類精度為83.33%,85.26%;1 kg樣品20,100 ng/g的分類精度為69.23%,95.73%。6針對黃曲霉毒素B1的快速檢測方法因為黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強的,所以隨著對黃曲霉毒素研究的深入,產生了很多對其快速檢測的方法。6.1免疫親和微柱檢測法免疫親和微柱檢測法的原理是

21、試樣提取液經過濾、稀釋后,通過黃曲霉毒素B1免疫親和柱。黃曲霉毒素B1免疫親和柱是由偶聯有黃曲霉毒素B1抗體的免疫親和微球填充而成的,而此抗體對黃曲霉毒素B1具有專一性,樣液中黃曲霉毒素B1被抗體捕獲,雜質隨洗滌液流出微柱,再以甲醇將黃曲霉毒素B1洗脫,洗脫液采用熒光光度法根據黃曲霉毒素B1檢測工作曲線測定黃曲霉毒素B1的含量。朱劍29等用免疫親和微柱法對大米,油脂,玉米粉做了黃曲霉毒素的檢測并與酶聯免疫吸附法作了比較,發現兩種檢測方法的準確度和靈敏度都比較高,免疫親和微柱法比ELISA的重復性好,對植物油中黃曲霉毒素B1含量檢測結果準確可靠。ELISA一次可以檢測多個樣本,適于大批量樣103

22、黃潔:黃曲霉毒素檢測方法研究進展品快速篩選,免疫親和微柱法一次只能檢測一個樣本,適于單一樣品現場快速檢測,都比較適合基層實驗室推廣使用。6.2一步式金標試紙法金標免疫層析(GICA是20世紀80年代初發展起來的一種快速免疫診斷技術。一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法是利用單克隆抗體而設計的固相免疫分析法,快速檢測試紙利用納米金作為標記物,可在510 min完成對樣品中黃曲霉毒素的定性測定。它不需進行結合標記物與自由標記物的分離,省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟,不僅提高了檢測速度,而且檢測過程中無需處理試劑,真正實現了一步式檢測30。Zhang等31利用一步式金標試紙法分析一個樣品,用時不到10 min

23、。在金標免疫試紙法的應用過程中,孫秀蘭等32研究了樣品基質對試紙條信號靈敏度的影響,為消除這些影響提供了經驗。鄧省亮等33用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標記為抗黃曲霉毒素B1。單克隆抗體并噴于玻璃纖維上,黃曲霉毒素B1偶聯抗原和二抗分別結合于硝酸纖維膜上,依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。測試結果表明,黃曲霉毒素B1快速檢測試紙條的靈敏度為5 ng/mL,檢測時間為10 min,批內和批間重復性100%,假陽性率和假陰性率均為0。6.3時間分辨熒光免疫分析法(TRFIATRFIA是超微量檢測中一項新興檢測技術,靈敏度較放射免疫分析(RIA高出3個

24、數量級。TRFIA原理與ELISA 一致,不同的是TRFIA采用了一種特殊的標記物,即3價稀土離子(Eu3+,Tb3+等代替酶標記物或其它熒光物,用時間分辨熒光儀測定產物中的熒光強度,從而判斷反應體系中分析物的濃度,達到定量分析的目的。TRFIA利用稀土元素熒光波長與其激發波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,可大幅度提高分析的靈敏度。黃飚等34采用自制黃曲霉毒素B1全抗原和多克隆抗體,構建了一套較為完整的黃曲霉毒素B1-TRFIA檢測平臺,具有較好的分析穩定性,靈敏度達到0.003 9 g/L,線性范圍0.003 9100 g/L。靈敏度和測量范圍均超越了市場上常用的進

25、口或國產酶聯免疫檢測試劑(分別為0.1 g/L和0.110 g/L,經過多方面考核,各項指標符合標記免疫試劑的要求,對食品、飼料等樣本檢測效果均佳,具有很好的應用前景。7結語綜上所述,黃曲霉毒素具有高的致癌、致畸性,因而受到全世界的廣泛關注。在人們對食品安全的意識不斷提高的今天,加強對黃曲霉毒素的監控和檢測非常必要。縱觀其發展趨勢,主要有兩個發展方向,即對現有方法的改進和新方法的開發。常用的檢測黃曲霉毒素的方法,即薄層色譜法、酶聯免疫法及高效液相色譜法,因檢測速度慢、精確度低、檢測費用高等原因而影響了對黃曲霉毒素監控的廣泛性及檢測的即時性,需要加以改進。傳統檢測方法的不足促使黃曲霉毒素快速、準

26、確檢測方法的研發,例如超光譜法,它是一種無侵入性,無損性,快速、準確檢測黃曲霉毒素的新方法,已經使用它對花生,玉米,辣椒,堅果類等進行了黃曲霉毒素的檢測,并且準確度較高,是以后發展的方向;還有像電子鼻法、生物傳感器等方法還不完善,需要改進,未來這些方法的發展會使快速、準確、安全的檢測黃曲霉毒素成為可能。參考文獻1Brown R L,Bhatnagar D,Cleveland T E,et a1. Recent advancesin preharvest prevention of mycotoxin contaminationC. KK Sinha(eds.Mycotoxins in Agri

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32、f SPIE, 2010, 7676: 1.化學分析計量 2013年,第22卷,第3期10429朱劍,等.糧食加工,2009,34(2: 9090.30鄧瑞廣,等.河南農業科學,2006(4: 9799.31Zhang Xuehui,et al. J Chromatogr Sci,2005,48(1: 4751.32孫秀蘭,等.西北農林科技大學學報:自然科學版,2007,35(7:188192.33鄧省亮,等.食品科學,2007,28(2: 232235.34黃飚.黃曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bl的超微量免疫分析D.江南大學博士學位論文,2006: 8990.兩會建議:食品農殘檢測納入國家層面建立

33、統一的食品藥品監管體系,杜絕食品添加亂象;推廣使用生物農藥,從源頭解決農殘問題。前不久,在十二屆全國人大一次會議分組討論會上,全國人大代表、安徽口子酒業股份有限公司董事長徐進就食品安全問題提出了一些建議。(1建立統一的食品藥品監管體系“添加劑是食品安全問題當中的一個重要方面,盡管國家對此有著嚴格規定,明確了食品添加劑的品種和用量,可在實際操作過程中,卻出現一系列問題,如濫用添加劑就是一個較為嚴重的現象。”徐進在發言時透露,國家明確規定的防腐劑是33種,每種添加劑的用量都有一個上限,可一些商家為了延長產品的銷售周期,盡管不超量使用某一種添加劑,卻選擇同時添加幾種添加劑,導致食品添加劑濫用的現象發

34、生。此外,有些食品添加劑的生產只是一些廠家的副產品,達不到相關標準。徐進還認為,多頭管理是導致食品藥品安全問題的重要原因之一。據介紹,我國的食品標準是由衛生部制定,工商局和食品藥品管理部門進行市場管理,各部門根據職能分工各管一段,在具體實施過程中,難免出現溝通不暢的情況,從而出現了監督和執法不到位等問題。對此,徐進建議,國家應盡快建立統一的國家食品藥品監管體系,解決食品藥品監管當中的多頭管理問題,嚴厲打擊食品藥品不法行為。(2嚴禁劇毒農藥,嘗試生物農藥食品安全問題應從源頭抓起,如何保證農產品的食用安全,關鍵是追本溯源,針對農藥殘留問題進行監管。如何監管農殘問題,徐進提出了兩點建議,一是嚴禁生產和使用劇毒農藥,推崇生物農藥;二是盡快研發出農殘檢測儀器,對農殘現象進行嚴管。“農殘問題令人生畏,可從市場監管來看,檢測體系仍不健全。”徐進說,在實際使用過程中,大家都沒有注意這個問題,可是這個問題事關民生甚至安全,應上升到國家層面。“能不能將生物農藥的使用和國家惠農政策結合起來,通過給予相關補助,鼓勵農民使用生態農藥,并嚴控農民使用劇毒農藥。”徐進說,盡管國家明令禁止生產劇毒農藥,可一些地方為了利益,還