1、吳 偉 華 許多化學物質具有顏色，有些無顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質。實踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對溶液中所含的物質進行定量分析。基于比較顏色深淺對溶液進行定量分析的方法稱為比色分析法。 溶液為什么會有顏色，顏色又為什么與濃度有關呢？下面就討論這個問題。 一、光的互補及有色物質的顯色原理 1光的波粒二象性 光是能的一種表現形式，是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質處發生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現象。可用波長、頻率、傳播速度等參量來描述，即光具有“波動性”。光的

2、顏色即由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長在400750nrn之間。在可見光之外是紅外光和紫外光。 同時，光也具有“粒子性”，光電效應就是一個很好的例子。光的粒子性理論認為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。在輻射能量時，光是以一份一份的能量E的形式輻射的，同時光被吸收時，能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為h。光子的能量與波長的關系為 E=h= hc 式中E為光子的能量（J：焦耳），為頻率，h為普朗克常數（6.6310-34JS），c為光速，為光的波長 因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波能量小。 2。光的顯色原理 若把某兩種顏色的光，按一定的強度比

3、例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補色。圖41中處于直線關系的兩種光為互補色。如綠光和紫光為互補色，黃光和藍光為互補色等等。 各種溶液會呈現出不同的顏色，其原因是溶液中有色質點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實驗證明：溶液所呈現的顏色是其主要吸收光的互補色。如一束白光通過高錳酸鉀溶液時，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過溶液。從互補色示意圖可以看出，透過光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。 二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律 溶液顏色的深淺與濃度之間的關系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計也

4、符合這個定律。 溶液對光的吸收 當一束強度為I的平行單色光照到溶液時，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過溶液，如圖4-2所示 有： I0=I a+ I r+ I t I0-入射光強度 I a-吸收光強度 I r-反射光強度 I t-透射光強度 通常由于I r很小可忽略不計，上式可簡化為 I0=I a+ I t 透射光I t與入射光強度I0之比為透光率或透光度，用T表示： T= I t/ I a 透光率的負對數稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示： A=lgT=lg1/T=lgI a/ I t 吸光度越大，表示該物質對光的吸收越強。透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸收的程度

5、，它們之間可據式相互換算。 實驗證明，單色光經過有色溶液時，透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關。其規律可用下式表示為 AKCL 式中：A（E）吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K某溶液的消光（吸收）系數； C溶液的濃度； L光程，即溶液的厚度。 消光系數K是一個常數。一種有色溶液對于一定波長（單色光）的入射光的K值具有一定的數值。若溶液的濃度以摩爾升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩爾消光系數。摩爾消光系數是有色化合物的重要特性之一，根據這個數值的大小，可以估計顯色反應的靈敏程度。 從上式可以看出，當K和L不變時，光密度E與溶

6、液濃度C成正比關系，也可以說，當一束單色入射光經過有色溶液且入射光、消光系數和溶液厚度不變時，吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。 這種單色光與有色溶液的關系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析方法就是根據這一定律來進行的。但是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。 三、朗伯-比爾定律的應用 1等吸光度法 從朗伯-比耳定律可知，當用同一光源照射同一物質的不同濃度溶液時，若吸光度相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關系在可見光區用眼作檢測器（目視比色法），即可求出待測溶液的濃度。 2計算法 根據被測溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標準溶液。用同

7、樣的方法處理標準溶液與被測溶液，使其成色后，在同樣的實驗條件下用同一臺儀器分別測定它們的吸光度。 在標準溶液中：As=KsCsLs 在待測溶液中：Ax=KxCxLx 如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長的單色光，保持溫度相同，則K也相等。將兩式相除可得 As/ Ax=Cs/Cx 由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設計一種儀器，可以測量吸光度A值，則待測溶液的濃度即可求出 Cx=Ax/ As Cs 由于儀器的性能和實驗環境在不斷的變化，所以在采用計算法時，必須每次都要對標準液和被測液進行測量，然后利用上式進行計算，否則會帶來較大的測量誤差。 由于一般光電比色計

8、在結構上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準確的結果，常采用標準曲線法。 3標準曲線法 這種方法分以下幾步： （1）先配制五種以上標準濃度的溶液。 （2）測出每種溶液的吸光度A。 （3）做AC標準曲線圖，如圖43所示。 有了標準工作曲線便可對溶液進行測量。在同樣的條件下，用儀器測出A后，查標準曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。 分光光度計顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm，蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白

9、質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。 蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。Lowry法：以最早期的Biuret反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Cu2+反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到

10、非蛋白物質的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏

11、感度好，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。 實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之后定量培養后的含菌培養液。需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。 主要技術指標 1. 樣品量：0.5-5 ul 2. 靈敏度 dsDNA：2-20000 ng/ul 3. 單機版操作: 內置軟件 4. 操作方式: 彩色觸屏和按鍵，可外接鼠標鍵盤 5. 測試協議：核酸，蛋白，菌液，細胞裂解物，UV-VIS 6. 數據輸出形式：數據圖表輸出，通過U盤，CSV格式文件，數據&圖表輸出或112mm寬打印