1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上常用中性粒細胞分離方法（外周血、骨髓提取均可）（1） Percoll非連續(xù)密度梯度離心法（張燦老師課題組使用方法）優(yōu)點：Percoll的主要成分是硅石膠，對中性粒細胞的化成成分和活性無影響。回收率高，存活率高。缺點：可能會有部分紅細胞分離不干凈，影響不大。 （2） Ficoll-Hypaque密度梯度離心法優(yōu)點：回收率高和percoll差不多。缺點：由于Ficoll結(jié)構(gòu)中的長鏈烴組成具有LPS樣作用，因此在分離過程中，會對中性粒細胞有激活作用。（3） Dextran作用下紅細胞自然沉降法優(yōu)點：能夠完全分離紅細胞缺點：回收率最低（4） 裂解紅細胞法優(yōu)點：能夠完全分離紅細

2、胞缺點：回收率低純度、回收率和存活率檢測方法純度：瑞吉染色存活：臺盼藍計數(shù)回收：分離后（計數(shù)）/分離前（血常規(guī)檢測）Percoll非連續(xù)密度梯度離心法（張燦老師實驗室的方法）和培養(yǎng)備注：使用外周血或骨髓提取都是可以的，一般來說，外周血每1ml能夠提取1*106 cell，數(shù)量比較少，如果骨髓提取，一只小鼠約能提取1*107 cell。外周血和骨髓提取除了來源不一樣，分離方式是相同的。1. 試劑耗材：percoll原液（pharmaciaor sigma） 10*PBS RPIM1640培養(yǎng)基2. 溶液配制（1） 用percoll原液和10*PBS按照9:1的比例（v/v）配成混合液，定義為10

3、0%percoll。（2） 用1*PBS和100%percoll 配置55%和65%的percoll。（溶液配制均在無菌環(huán)境下操作）3. 分離步驟（1） 小鼠酒精浸泡消毒。（2） 小鼠頸椎脫臼處死，立即切下其后肢的脛骨和股骨，并分離除去所有組織、皮膚。將脛骨和股骨浸泡在不含有血清的RPIM1640培養(yǎng)基中。（3） 剪短脛骨股骨兩端，用1ml注射器想脛骨股骨中吹灌不含有血清的RPIM1640培養(yǎng)基重懸得到骨髓細胞重懸液，一直吹到骨片泛白為止。（4） 將含有骨細胞的RPIM1640培養(yǎng)基4000rpm離心3分鐘。（5） 用RPIM1640培養(yǎng)基重懸得到骨髓細胞。（2ml）（6） 取一個新離心管，加

4、入2ml65%percoll分離液，再加入2ml55%percoll分離液，最后加入2ml骨髓細胞液。（緩慢不要破壞溶液界面）（7） 2500rpm離心30分鐘。吸取55%和65%交界面，加入1*PBS，1000rpm離心3分鐘，棄上清，重復(fù)3次。（8） 用RPIM1640培養(yǎng)基重懸得到小鼠骨髓中性粒細胞懸浮液。注意：（1） 中性粒細胞為終末細胞，不可傳代壽命短。（2） 張老師組一般細胞和藥物共同富裕1小時。（3） 3-4小時以內(nèi)，細胞狀態(tài)都比較好。PS：也可以用45%55%80%三層分離，500 g離心30分鐘，棄上清和55%以上部分，下午55-80%交界面。加入1倍體積的1*PBS，200

5、g離心3分鐘，。后同。人血漿提取問題1. 新鮮血液，中性粒細胞壽命較短。2. 采學后，用EDTA抗凝處理。3. 具體需血量根據(jù)需求來定：每1ml血=1*106 cell。 文獻說如果做wb，大約要30 ml血液。后續(xù)的一些實驗方法1. 中性粒細胞tranwell藥物趨化實驗（1） 分離中心粒細胞，測定細胞數(shù)（2） transwell小室下室加600ul的趨化因子+無血清培養(yǎng)液（3） 上室加入100ul細胞+無血清培養(yǎng)液（4） 孵育2小時（5） 拿出小室，將上室取出放新的孔內(nèi)，先將膜上細胞擦去后，再予以離心，將膜下粘附細胞離心至下室，然后予以CCK8間接測定細胞。（6） 會有細胞掉到下室，有文獻是分開固定計數(shù)的。2. 中性粒細胞株只有中性粒前體細胞的細胞株，然后誘導分化得到中性粒細胞。HL60. NB4均可。3. 流式檢測凋亡檢測和材