1、精選優質文檔-傾情為你奉上生物技術藥物的質控體系質量標準研究內容檢定方法、質控標準n 理化性質：外觀（形狀、顏色、氣味）、pHn 均一性：純度、濃度n 鑒別n 結構確證n 效價：生物學活性、免疫學活性n 殘余雜質：產品、工藝、環境相關的雜質n 起草、制定制造與檢定規程n 研究建立國家標準品或參考品重組蛋白質藥物質量標準研究n 效價：生物學活性與比活性n 蛋白質純度n 蛋白質含量n 理化性質鑒定（部分非常規）n 殘余雜質n 安全性及其它項目一 生物學活性及比活性測定(一) 檢測意義 獲取準確的效價信息，保證產品有效效價：有效性指標，反映藥品效力生物學活性才能真實反映生物技術藥效價原因：生物制品分

2、子大、結構復雜、不穩定，使得重量與效價不一致生物制品技術藥：單位（U、AU、IU）（二） 生物學活性測定方法分類1、動物基礎的活性測定 離體動物器官法：腦利鈉肽的兔主動脈 體內測定法： EPO的小鼠網織紅細胞2、細胞基礎的活性測定n 促細胞生長法：大多數細胞因子類n 抑制細胞生長法：細胞毒素、血管抑制劑n 間接保護細胞法：IFN保護WISH3、酶學基礎的活性測定：重組酶類4、受體-配體、抗原-抗體結合基礎的活性測定： 抗原決定簇與活性中心常不一致（三）生物學活性測定方法選擇1、細胞培養法離體器官法體內法2、細胞染色標記方法： MTT 3H-Thymidine 流式細胞儀 （測細胞周期、凋亡）3

3、、定量法半定量法定性法4、生物學活性不一定與臨床藥效類型一致工藝穩定、測生物活性特別復雜時，可替代。 如rh-GH用HPLC（四）生物學活性測定（見藥典附錄C）1、樣品：原液、成品2、方法：如上述（好好研究？）3、標準： 不同生物活性測定方法的規定標準 測定方法 規定標準動物基礎的活性測定 70%-130%標示量細胞基礎的活性測定 80%-120%標示量酶學基礎的活性測定 85%-115%標示量結合反應的活性測定 85%-115%標示量（五）蛋白質藥物的比活性（見分生實驗冊77頁）？1、樣品：原液2、定義與計算： 比活性：單位重量蛋白的活性單位數（IU/mg)3、標準：不小于。IU/mg4、意

4、義：1）真實反映有活性的蛋白質所占的比例 廠家間、表達系統間、批間比較2）便于配制成品二 蛋白質純度檢查n 樣品：原液n 方法：必須采用二種方法測定 非還原SDS-PAGE法 HPLC法n 標準：純度均須達到95%或98%以上非還原SDS-PAGE法測定純度（見藥典附錄C）n SDS-PAGE：據分子大小分離n 樣品處理：樣品不加-ME或DTT 二硫鍵未打開，反映單體、二聚體或多聚體情況n 染色方法與上樣量 銀染: 5ug（檢測限為1-10ng） 考馬斯亮藍R-250：10ug（檢測限為0.1ug）n 定量方法：凝膠掃描n 標準：無明顯雜帶，純度95%或98%HPLC法測純度？（見藥典附錄B）

5、n 分析柱：反相柱、離子柱、分子篩 應盡量采用反相柱或離子柱 應注明采用的分析柱性質n 上樣量：5ugn 標準：出峰時間正確 純度：95%或98%三、蛋白質含量測定(見藥典附錄D)n 樣品：原液、成品n 方法：*Folin-酚試劑法（Lowry法）：（見分生實驗冊67-73頁） 簡便、靈敏、優先采用，靈敏度：5-100ug/ml *染色法（Bradford法）： 考馬斯亮藍G-250，簡便靈敏， 25-200ug/mlBCA(二喹啉甲酸)法：操作簡單，比Lowry法快4倍且更加方便，準確靈敏：20200 ug/ml，微量BCA的測定范圍在0.510 ug/ml。經濟適用 ，抗試劑干擾能力比較強

6、。紫外分光廣度法： 用于原液比活性計算和成品規格控制四、蛋白質藥物理化性質鑒定（一）特異性鑒別試驗1、樣品：原液和成品2、方法：免疫印跡法 Western Blot、 Dot Blot3、標準：應該陽性（二）相對分子量測定1、樣品：原液2、方法：還原型SDS-PAGE（見分生實驗冊51頁、見藥典附錄C）、質譜法3、標準： 1）理論值±10%范圍 2）批與批間一致（三）等電點測定（見藥典附錄D）1、樣品：原液2、方法： IEF：常規等電聚膠電泳（見分生實驗冊55-57頁） CE：毛細管電泳3、標準： 1）有明顯主帶 2）理論值±0.5pH范圍 3）批與批間一致（四）紫外吸收光

7、譜分析（見藥典附錄A）1、樣品：原液2、方法：紫外掃描3、標準： 1）最大吸收波長與特征波長一致 2）批與批間一致（五）肽圖分析（非常規）（見藥典附錄E）1、樣品：原液2、方法： 溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/質譜法3、標準： 1）有特征性圖譜 2）批與批間一致（六）氨基酸組成分析（非常規）1、樣品：原液2、方法： HCl/NaOH水解（僅用于Trp測定） +氨基酸自動分析儀3、標準： 1）與理論值一致 2）批與批間一致（七）氨基酸序列分析（非常規）1、樣品：原液2、方法： N末端： 15個殘基， Edman化學降解法，蛋白質全自動測序儀 C末端： 1-3個殘基 硫

8、氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC3、標準： 1）與理論值一致 2）批與批間一致（八）其它：二硫鍵、糖基化（非常規）五、殘余雜質檢測（一）宿主相關雜質 宿主細胞蛋白含量：（見藥典附錄C）1、樣品：原液、成品2、方法： 雙抗體夾心ELISA：用HAS作保護 宿主蛋白標準品：中檢所提供3、標準： 1）大腸桿菌0.1% 2）CHO 0.05%宿主細胞DNA含量（見藥典附錄B）1、樣品：原液、成品2、方法： DNA點印跡雜交法，地高辛標記 DNA標準品：廠家提供3、標準： DNA含量10ng/劑量細菌內毒素含量（見藥典附錄E凝膠限量實驗）1、樣品：原液、成品2、方法： 鱟試劑分析法鱟試劑標準品：中檢

9、所提供3、標準： 內毒素含量1/劑量（二）工藝相關雜質（見藥典附錄A） 如殘余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清（三）產品相關雜質 如多聚體、不同的PEG修飾產物六、安全性及其它檢測項目（一）無菌試驗 平皿法，需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體（二）熱原試驗 鱟試劑法或家兔法（三）異常毒性試驗 小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射（四）水分、裝量、pH值原液質量標準n 生物學活性、比活性（見藥典附錄C）n 蛋白質含量(見藥典附錄D)n 純度：95%，非還原SDS-PAGE法（見藥典附錄C）、HPLC法（見藥典附錄B）n 分子量：還原型SDS-PAGE法（見藥典附錄C）、質譜法n 外源性DNA殘留量： 10ng/劑量（見藥典附錄B）n 宿主蛋白殘留量: 0.1%，0.05%（見藥典附錄C）n 殘余抗生素：不得檢出（見藥典附錄A）n 細菌內毒素：10EU/劑量（見藥典附錄E凝膠限量實驗）n 結構確證：等電點（見藥典附錄D）、紫外吸收光譜掃描（見藥典附錄A）、