1、抗型膠原抗體的檢測及其在類風濕關節炎中的意義         【摘要】目的了解抗型膠原抗體在類風濕關節炎(RA)中的臨床意義。方法以改進的酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測179例RA患者和171例其他風濕病患者的血清IgG型抗天然及抗變性型膠原抗體水平。結果RA患者抗天然和抗變性型膠原抗體陽性率各為22.3%和36.9%，早期RA患者各為30.0%和36.7%。其他風濕病患者中各為3.5%和31.6%，健康人二者均為2.5%?？固烊恍湍z原抗體陽性RA患者類風濕因子檢出率、患者對病情活動性評價高于陰性組(P0.05)

2、?？棺冃孕湍z原抗體和抗天然型膠原抗體同時陽性RA患者的CRP平均水平較高。結論抗天然型膠原抗體可以作為RA的一個輔助診斷指標。抗天然與抗變性型膠原抗體的檢測有助于判斷RA病情活動性。 Anti-type collagen antibodies in rheumatoid arthritis  【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical significance of anti-type-collagens antibody in rheumatoid arthritis (RA).MethodSerum IgG antibodies

3、to native and denatured type collagens (anti-nc and anti-dc ) were detected in 179 patients with RA by an improved enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),and their clinical significance was analysed with corresponding clinical materials.ResultsIn RA,the positive rates of anti-nc and anti-dc were

4、22.3% and 36.9%;in early RA were 30.0% and 36.7%,respectively.In other rheumatic diseases the positive rates were 3.5% and 31.6%,respectively and were both 2.5% in healthy controls.Anti-nc positive RA showed higher prevalence rate of RF and higher scores of patients global assessment of disease acti

5、vity (P 0.05).The presence of anti-nc and anti-dc concomitantly was associated with high CRP level in RA patients.ConclusionAnti-nc could serve as a supplemental parameter in diagnosing RA and together with anti-dc may help evaluate the disease activity. 【Key words】Rheumatoid arthritis;Anti-type col

6、lagen antibody;Enzyme-linked immunosorbent assay;C-reactive protein 抗型膠原抗體(antibodies to type collagen)與類風濕關節炎(RA)病情活動性、嚴重性的關系目前仍有爭論。本研究參照Fujii等1提出的實驗條件檢測179例RA患者、171例其他風濕病和118名正常人血清的抗型膠原抗體，探討其在RA中的臨床意義。結果報告如下。 1資料與方法 1.1一般資料 1.1.1病人組：為1994年9月至1999年3月在汕頭大學醫學院第一附屬醫院風濕科住院、門診、隨訪的RA患者，共179例，全部符合1987年美國風

7、濕病協會(ARA)的RA分類標準2。其中男性53例，女性126例，年齡1776歲，平均46.3歲。其中病程1年之內，X線未出現明顯骨質破壞者(以下簡稱早期病例)30例。 1.1.2對照組：共289例，分為兩組：一組為同期在汕頭大學醫學院第一附屬醫院風濕科門診或住院的非RA的其他風濕性疾病患者171例；另一組為正常對照組，共118名。 1.2抗型膠原抗體的體測 參照Fujii等1的方法。 1.2.1微量反應板的包被及封閉：正常羊血清于62 加熱20 min，加入固體Tris (0.05 mol/L)、NaCl (0.15 mol/L)和2 mol/L HCl，調pH值至8備用(BNGS)。天然型

8、膠原在46 水浴中加熱20 min，即為變性膠原。 將天然型和變性型膠原分別溶解于0.05 mol/L的醋酸中，濃度為3 mg/ml。0.02 mol/L磷酸緩沖液(PB) pH 7.6稀釋膠原溶液，使濃度為40 g/ml，加入微量反應板孔，每孔100 l，保鮮膜覆蓋，4 過夜。 在與待檢血清標本進行溫育之前，包被好的微量反應板用含0.05%吐溫20的生理鹽水溶液洗滌3次，然后每孔加入100 l BNGS，室溫(2428 )下封閉30 min，洗滌液洗滌3次。 1.2.2檢測：BNGS稀釋待檢及陽性對照、陰性對照血清，轉入微量反應板的微孔中，設二孔平行，每孔100 l，同時設空白對照。室溫溫育

9、2 h，生理鹽水-吐溫溶液洗滌3次。含25%BNGS的0.1 mol/L TBS pH 8.0溶液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG，每反應 孔加入100 l，室溫溫育2 h，洗滌。將聯苯二胺和過氧化氫溶解于檸檬酸-磷酸緩沖液pH 5.0中，使各自濃度分別為0.05%和0.017%，加入反應孔，每孔100 l，37 溫育30 min后每孔加入終止液1.25 mol/L硫酸50 l終止反應，酶標分光光度計492 nm處測吸光度(A)值。 1.2.3結果判斷：以正常血清的平均A值加3個標準差作為正常值上限，待檢血清A值超過者即被認為是陽性。    

10、0;   1.3統計學處理 計量資料數據采用t檢驗，計數資料數據采用2檢驗。 2結果 2.1ELISA工作濃度的選擇：為便于比較，選擇工作濃度時以天然型膠原作為包被抗原，測定血清抗天然型膠原抗體水平。 參照文獻3的方法進行。結果表明，型膠原包被液濃度以40 g/ml，第二抗體辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG稀釋度以1400，血清以140稀釋為最佳。 2.2RA患者及對照組血清抗型膠原抗體檢測結果：179例RA患者中，抗天然型膠原抗體陽性者40例，陽性率22.3%，顯著高于健康人和疾病對照組(3.5%和2.5%)(P0.05)；抗變性型膠原抗體陽性者66例，陽性率36

11、.9%，與正常對照組(2.5%)相比差異有極顯著性(P0.000 1)，與其他風濕病(31.6%)差異不大。30例早期RA患者抗天然型膠原抗體陽性9例，陽性率為30.0%。 抗天然型膠原抗體對RA診斷的敏感性為22.3%，特異性為96.9%，抗變性型膠原抗體對RA診斷的敏感性為36.9%，特異性為80.3%。 2.3抗型膠原抗體與RA病情的關系：抗天然型膠原抗體陽性患者RF陽性率高于陰性組(79.5%對61.8%，P0.041)，病情活動評分較高(8.5±9.5對6.6±1.5，P0.027)?？棺冃孕湍z原抗體陽性RA患者血清CRP平均水平較陰性組高(24.8%對19.6%

12、，P0.003)。晨僵時間、壓痛關節數、腫脹關節數、干燥綜合征并發率、類風濕結節的發生率、功能分級二組間無統計學差異。IgG、IgM、IgA、-球蛋白，ESR水平、ANA陽性率及滴度、放射學病情進展及使用SAARDs的比例等方面在陽性組與陰性組無差異。抗變性型膠原抗體陽性的早期RA患者ESR、CRP水平較陰性組增高(P0.05)。 27例抗天然型膠原抗體陽性RA患者抗變性型膠原抗體同時陽性。本組病人RF檢出率高于其他RA患者(P0.05)。CRP水平也較高(19.6±17.5對16.8±16.0，P0.007)。      

13、3討論 抗型膠原抗體檢測方法有多種，目前以ELISA法應用最為廣泛。Fujii等1比較了吐溫20、牛血清白蛋白和一些動物血清(如兔、雞、牛、羊)阻止人血清免疫球蛋白與酶標微量反應板的吸附作用后認為，與其他動物血清及吐溫20相比，兔和羊血清減少非特異性吸附作用效果最好。他用正常新鮮兔血清封閉酶標反應板，使RA病人與健康對照者血清的抗型膠原抗體滴度差異明朗化，并進一步提出該抗體可作為RA的一早期診斷指標4。我們雖未做多種動物血清封閉酶標反應板的比較，但通過采用Fujii等改進的ELISA檢測血清抗型膠原抗體水平后我們發現，對照組抗天然型膠原抗體陽性率甚低，使其對RA的診斷特異性達96.9%，在早期

14、RA中敏感性略高于非早期RA患者，表明該抗體的檢測可以作為對RA診斷的一個補充。 本組RF檢出率在抗天然型膠原抗體陽性RA患者較陰性組高，且有統計學意義。與林冰等5所觀察到的結果一致。國外的報道多認為抗天然型膠原抗體陽性與RF檢出率無關6。是否存在人種差異，有待進一步證實。 CRP為一急性時相反應產物，其水平可作為判斷RA活動性的一個指標。Morgan等7報道僅部分RA患者CRP與抗天然及抗變性型膠原抗體 水平相關。本組179例RA患者抗變性型膠原抗體陽性者血清CRP平均水平明顯高于陰性組，且有高度的統計學意義?？固烊恍湍z原抗體陽性組患者CRP水平偏高。早期RA抗變性型膠原抗體陽性患者ESR、

15、CRP水平顯著較陰性者為高，提示這組患者炎癥活動似更為顯著。 Charriere等8研究認為，抗天然型膠原抗體陽性與患者X線病情進展較慢、較輕有關。但林冰等5報道抗天然型膠原抗體陽性RA患者關節X線分期較高，認為該組病人病情更重。我們的研究未發現抗天然型膠原抗體陽性組與陰性組在放射學分期、Sharp評分上有統計意義的差別。 在本研究中，RA患者抗天然型膠原抗體陽性者抗變性型膠原抗體多呈陽性，單純抗天然型膠原抗體陽性者較少(占全部抗天然型膠原抗體陽性RA患者的31.7%)。進一步分析抗天然和抗變性型膠原抗體與臨床的關系發現，抗天然型膠原抗體陽性與否對抗變性型膠原抗體與CRP水平的關系有影響：當抗

16、天然型膠原抗體陰性時，抗變性型膠原抗體與CRP水平即無明顯關系，表明抗天然型膠原抗體狀況對活動性同樣起著關鍵作用，檢測抗型膠原抗體有助于對RA活動性的估計。 參 考 文 獻 1,Fujii K,Tsuji M,Murota K,et al.An improved enzyme-linked immunosorbent assay of anti-collagen antibodies in human serum.J Immunol Methods,1989,124:63-70. 2,Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheum

17、atism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31:315-324.        3,馬東來，張敏，許華林，等.類風濕關節炎患者血清型膠原抗體檢測.中國實驗臨床免疫學雜志，1996，8：28-30. 4,Fujii K,Tsuji M,Kitamura A,et al.The diagnostic significance of anti-typ

18、e collagen antibody assay in rheumatoid arthritis.Int Orthop,1992,16:272-276. 5,林冰，吳東海，張榮富，等.類風濕關節炎患者抗天然型膠原抗體的測定及臨床意義.中國康復醫學雜志，1997，12：170-172. 6,Choi EK,Gateaby PA,McGill NW,et al.Autoantibodies to type collagen:occurrence in rheumatoid arthritis,other arthritides,autoimmune connective tissue diseases,and chronic inflammatory syndromes.Ann Rheum Dis,1988,47:313. 7,Morgan K,Clague RB,Collins I,et&