1、菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測定及其指紋圖譜研究                         作者：符少蓮，周光雄，黃美燕【摘要】 目的建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質類化合物的HPLC含量測定方法，并對提取物HPLC指紋圖譜條件進行研究分析。方法采用反相C18柱（4.6 mm×200 mm，5 m），甲醇0.5%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫

2、，柱溫為25，流速為0.8 ml/min，在276 nm下進行檢測。結果菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖的含量為85.7 mg/g，加樣回收率為92.49%；1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖的含量為244 mg/g，加樣回收率為96.41%；初步探討了菱角皮提取物的指紋圖譜條件。結論采用高效液相法測定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質類化合物的含量，簡便、快速、準確；初步得到分離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，為以后建立指紋圖譜和制定菱角皮藥材及其活性提取物的質量標準提供了依據。 【關鍵詞】 菱； 果皮； 鞣酸； 高效液相色譜； 指紋圖譜Abstract：Ob

3、jective To establish determination method of tannin compounds from bioactive ethyl acetate extract of the fruit crust of Trapa bispinosa Roxb by HPLC, and to study on analysis conditions of HPLC fingerprint of the extract. MethodsUse reverse phase C18 column（4.6 mm×200 mm，5 m）, detection wave-l

4、ength at 276 nm, column temperature at 25, flow rate at a 0.8 ml/min, and gradient aqueous methanol solution containing 0.5% acetic acid as a mobile phase.ResultsThe determination of tannic acid compound 1, 2, 6-tri-galloyl- D-glucose from the extract was 85.7mg/g, and the average recoveries was 92.

5、49%; the determination of tannic acid compound 1, 2, 3, 6-tetra-galloyl-D -glucose was 244 mg/g, and the average recoveries was 96.41%; a preliminary study on conditions of HPLC fingerprint for the bioactive extract was carried out. ConclusionThe determination method for the tannin compounds from et

6、hyl acetate extract of the fruit crust of the plant by HPLC is simple, fast and accurate. Chromatographic conditions of ethyl acetate extract of the plant was initially obtained, which provide the basis for establishment of the HPLC fingerprint and making quality standard of the crude drug and its b

7、ioactive extract from the plant.Key words：Trapa bispinosa Roxb; Fruit crust; Tannin; HPLC；Fingerprint 菱Trapa bispinosa Roxb，一年生浮水或半挺草本，屬菱科。我國有15種和11變種，產于全國各地，以長江流域亞熱帶地區分布與栽培最多1。其性甘味涼，無毒，入腸、胃二經，有清熱祛暑、除濕祛風、益氣健脾之功2。菱殼，為菱科植物菱或其同屬植物的果皮。其作為藥物始載于本草綱目拾遺。據中華藥海所載，其性味微苦、澀，涼，入肺、脾、大腸三經，具有解毒療瘡、澀湯止瀉、清化濕熱的功效2。 經查閱文

8、獻得知，東北菱T. manshurica Flerov菱角的提取物確實有一定的抗腫瘤活性35。在我們的前期工作中，選取菱Trapa bispinosa Roxb的菱角皮作為研究對象，采用MTT法對菱角皮提取物抗肝癌HepG2細胞活性成分進行活性追蹤，采用液液萃取提取物各極性部位，也證實了菱角皮醋酸乙酯提取物對HepG2細胞有一定的抑制作用；采用反相C18柱層析和sephadex LH-20排阻層析分離活性成分，得到兩個鞣質類化合物1, 2, 6-三沒食子酰-D-葡萄糖（1）和1, 2, 4, 6-四沒食子酰-D-葡萄糖（2），對該兩個化合物進行了抗癌活性實驗，證實其對HepG2細胞有一定的抑制

9、作用（待發表）。此前，有研究表明存在于東北菱菱角中的沒食子酸具有誘導Hela腫瘤細胞凋亡的作用3。兩個化合物化學結構式見圖1。                              本研究將對菱角皮的醋酸乙酯活性部位中鞣質類化合物進行HPLC定性定量方法研究，旨在建立HPLC含量測定方法，并對菱角皮醋酸乙酯提取物H

10、PLC指紋圖譜條件進行研究分析。1 儀器與材料1.1 儀器Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀，電子天平（ACCULAB sartorius group），旋轉蒸發儀（EYELA）。1.2 藥材菱殼為從湖南長沙購買的菱角（第1批）、江西采集的菱角（第2批）和購買的菱角（第3批）果實去肉后的硬殼，藥材經暨南大學藥學院生藥學教研室鑒定為菱Trapa bispinosa Roxb的果殼。藥材樣品留存于暨南大學藥學院生藥學教研室。1.3 標準品1, 2, 6-三沒食子酰-D-葡萄糖（1）、 1, 2, 4, 6-四沒食子酰-D-葡萄糖（2）和沒食子酸（3）對照

11、品為本實驗室提純物,其中（1）和（2）為從該實驗提取物中分離得到，并經光譜法鑒定結構。甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司產品；其余試劑為分析純。2 方法與結果2.1 HPLC定量分析2.1.1 色譜條件色譜柱為依利特C18柱（4.6 mm×200 mm，5 mm）；檢測波長：276 nm；柱溫：25；流動相：A 甲醇，B 0.5乙酸水溶液；梯度洗脫條件：010 min，10%A20%A；1030 min，20%A40%A；3032 min，40%A100%A；3242 min，100%A；4247 min, 10%A；流速：0.8 ml/min。 在上述色譜條件下，化合物1 峰的保留

12、時間在20.55min左右，化合物2峰的保留時間在25.31min左右，化合物3保留時間在6.10min左右,并且分離度良好。對照品、供試品高效液相色譜圖見圖2。2.1.2 對照品溶液的制備精密稱取化合物10.002 3 g，置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46 mg/ml的化合物1標準液。 精密稱取0.004 1 g，化合物2置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.82 mg/ml的化合物2標準液。 精密稱取化合物30.002 1 g，置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46 mg/ml的化合物3標準液。2.1.3 供試品制備取菱角皮，粉

13、碎成細粉，取粉末100 g，用5倍量85%乙醇冷浸兩次，第1次為72 h，第2次為48 h，過濾前超聲兩個小時，過濾，合并冷浸液，濾液低溫（<60）減壓回收乙醇，濃縮得菱角殼提取物。將此提取物用適量水（100 ml）混懸，再依次用石油醚（50 ml）、氯仿（50 ml）、醋酸乙酯（50 ml）萃取水混懸液各3次，減壓下蒸干溶劑，得醋酸乙酯提取物。2.1.4 標準曲線的制備分別取化合物化合物1，化合物2和對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，以甲醇定容至10 ml容量瓶中，制得不同濃度對照品溶液。精密吸取20 ml注入高效液相色譜儀，以對照品濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐

14、標，線性回歸得化合物1方程：Y=58 399X-147.85，R=0.999 6；化合物2方程：Y=52 715X-241.24，R=0.999 8。 結果表明化合物1在0.009 20.046 mg/ml，化合物2在0,01640.082 mg/ml范圍內線性關系良好。2.1.5 精密度實驗取化合物1對照品溶液，精密吸取20 ml進樣，重復進樣5次，測得化合物2峰面積平均值為1 980.7，RSD為1.52%。2.1.6 穩定性實驗分別于0，1，2，4，8，12 h對同一供試品溶液進樣測定，進樣量為20 ml，結果化合物1平均峰面積為1351.86，RSD為1.79%，化合物2平均峰面積為3

15、 622.48，RSD為1.24%，表明供試品溶液在12 h內穩定。2.1.7 重復性實驗精密稱定菱角皮醋酸乙酯提取物5份各0.003 0 g于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密吸取20 ml進樣測定。結果見表12。表1 化合物1峰重復性實驗結果（略）表2 化合物2峰重復性實驗結果（略）2.1.8 加樣回收率實驗                        &

16、#160;     化合物1加樣回收率實驗:精密稱取化合物1 0.002 6 g于25 ml容量瓶，并精密稱取0.002 1 g菱角皮醋酸乙酯提取物于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；再分別吸取該化合物1溶液1 ml和菱角皮醋酸乙酯提取物溶液5 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；吸取20 ml進樣測定，按該法平行測量3次。結果見表3。表3 化合物1加樣回收率實驗結果（略） 化合物2加樣回收率實驗：結果見表4。表4 化合物2加樣回收率試驗結果（略）2.1.9 樣品含量測定精密稱取0.003 0 g菱角皮醋酸乙酯提取物于10 ml容量瓶中，甲醇定容

17、至刻度。精密吸取20 ml進樣，重復進樣5次，測得化合物1峰面積平均值為1 354.28，RSD為1.52%，化合物1含量為85.7 mg/g；化合物2峰面積平均值為3 622.48，RSD為1.24%,化合物2含量為244 mg/g。2.2 指紋圖譜研究2.2.1 色譜條件色譜柱為依利特C18柱（4.6 mm×200 mm，5 m）；檢測波長：276 nm；柱溫：25；流動相：A甲醇，B 0.5%乙酸水溶液；梯度洗脫條件：015 min，10%A20%A；1530 min，20%A50%A；3060 min，50%A100%A；6065 min，100%A；6575 min,10%

18、A；流速：0.8 ml/min。2.2.2 方法學驗證 重復性實驗:精密稱定“2.1.3”項下制備的菱角皮醋酸乙酯提取物0.002 0 g各5份于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密吸取20 ml進樣，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD小于1.5%。 穩定性實驗：已在“2.1.6”項下證明了菱角皮醋酸乙酯提取物溶液在12 h內穩定。 精密度實驗：已在“2.1.5”項下證明了該環境下測量精密度良好。 指紋圖譜：選取不同產地藥材兩角菱皮和四角菱皮按“2.1.3”項下要求制備醋酸乙酯提取物，并分別精密稱定0.002 0 g于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取20 ml進樣，所得

19、譜圖與“2.3”項下制備的菱角皮醋酸乙酯提取物進行對比。結果見圖36。 由圖35可得，3個藥材都在5.645，22.803，24.314，25.66，45.66，48.391，52.406 min左右出現特征色譜峰。 分別吸取化合物1，2，3對照品溶液于該色譜條件下進樣，可知5.645 min色譜峰為沒食子酸，22.803 min色譜峰為化合物1，25.66 min色譜峰為化合物2。3 討論 本研究對菱角皮抗腫瘤活性部位兩個鞣酸類主要成分1，2, 6-三沒食子酰-b-D-葡萄糖和1, 2, 4, 6-四沒食子酰-b-D-葡萄糖首次進行了定量分析方法研究并進行了樣品HPLC定量分析，首次初步分析了菱角皮醋酸乙酯提取物活性部位的HPLC指紋圖譜。結果表明采用高效液相法可測定菱角皮醋酸乙酯提取物中兩個鞣酸類化合物的含量，具有簡便、快速、準確特點，所建立的HPLC提取物指紋圖譜分析方法可用于該活性部位質量控制。選用文獻報道的流動相甲醇-0.5%乙酸