1、C.15 魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實驗1 方法這個短期的毒性實驗是重復 OECD TG 212（1998）上的。1 引言這個魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實驗是一個將生命從受精卵到幼苗期這段時間暴露在危險中的短期實驗。在胚胎期和幼苗期沒有飼料提供，而實驗將這樣終止，但是幼苗仍將從卵囊中繼續培養。本實驗打算劃定在測定的特殊時期和種類中足以致死的和非致死的化學物質。這個實驗將提供許多有用的信息包括：a、是一座架在致死和非致死間的橋梁；b、可以作為一個對不完全初期生物時期或慢性毒物的審查性實驗；c、對在某處耕作技術還未充分發展到可以包括內部生長到內部飼養改變時期的物種做測定。可能認為只有混合魚生命

2、循環中所有周期的實驗才可能對慢性毒物對魚的影響作出一個準確的評估，而且那些在生命各時期方面減少的暴光度可能會減少敏感度而因此低估了慢性毒物。為此預計胚胎期和幼苗期實驗特別是在一些高親脂性化合物及有特殊毒性效果的化學物質方面不如全程生命實驗敏感。盡管如此，可能在2個實驗中有一些不特殊的有麻醉效果的物質在敏感性上有更微小的差異（1）。在發表這個實驗之前，這種胚胎-幼苗期實驗的經驗多以一種叫Danio rerio的淡水魚（硬骨魚，鯉科，普通名稱斑馬魚）。更多關于這個系列的實驗演示的詳細指導在附件1中給出。這個并未避開使用其他可用的經驗（表格1）。1 定義最低觀測影響濃度（LOEC）：是一種被觀測物質

3、在對比于對照實驗有明顯影響（當p<0.05）的情況下在測定的最低濃度。無觀測影響濃度（NOEC）：是實驗濃度中低于LOEC的濃度。 實驗原理胚胎和幼苗期的魚被暴露在一系列不同濃度的溶有實驗物質的水中。在草案中，可能要在半穩態實驗和流動法實驗中做出一個選擇。而這個選擇取決于實驗物質的性質。這個實驗始于將受精卵放入實驗擴展槽中而終于在任一實驗擴展槽中的卵黃被幼蟲全部同化之前或饑餓死亡率超出對照之前。將致死和非致死影響與對照實驗對比、評估，并測出LOEC和NOEC。相互地，也可以用回歸分析來估計濃度而導致的百分比影響（即：LC/Ecx，這里x定義為影響百分比）。 實驗物質信息一個精確的毒性實驗

4、結果能更好的顯示出一系列對實驗的選擇，是可利用的。這個實驗結果可以用在選擇早期生命實驗中可處理的實驗濃度范圍。還要知道實驗物質在水中的溶解性（包括在實驗用水中的溶解性）和實驗物質的飽和蒸汽壓。在一個已知的、精確實驗結果報告并且限量探測的實驗方案中一個可靠的物質定量分析方法是有效的。結構公式，物質的純度，在水中和光照下的穩定性，Pka，Pow以及預備生物降解的結果都是有用的信息。 實驗的有效性對一個有效的實驗，應當遵循以下幾點：所有對照實驗中相關的繼續存活的受精卵及相關在僅溶的容器中的量不少于附件、中所定義的限制；在整個實驗中溶解的氧氣濃度必須在空氣飽合含量的60%100%之間；在實驗擴展槽或整

5、個實驗中任何連續幾天時間水溫變化不超過±，并且在一系列實驗中指定的溫度范圍內（附件2、3）。1.實驗方法描述實驗擴展槽可以使用任何玻璃或其他任何化學惰性容器。容器的尺寸應大至足夠允許滿足投放比率（見章節.2）。要求實驗擴展槽在實驗地區的某一隨機位置。當存在實驗室系統誤差時，一個對每個分步驟處理方式的分步驟預想對完全隨機方案是有好處的，并能夠進行適當控制。分步驟，如使用，要注意隨后的數據處理，而實驗擴展槽要小心防備以外打擾。 魚品種的選擇可接受的魚的品種在表格1A中已給出。這里不能避免使用其他種類（例如：在表格1B中所列出的），但實驗步驟上可能不得不提供更好的實驗條件來適應實驗步驟。在

6、這種條件下實驗結果報告出了選擇的基本原則和實驗方法。養殖魚種類的選擇關于養殖魚種類的細節可在OECD TG 210和參考文獻（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中找到。 胚胎和幼苗的處理在主容器中，胚胎和幼苗是暴露在外的，在小點的容器中在側面和底部安裝網使得容器里允許實驗的水流動。那些計劃好的懸浮在臂狀物上的小容器使得容器上下搖動會產生不狂暴的水流流過小容器，但總能保持有機體浸沒在水中。在使用一個虹吸系統。鮭魚的受精卵被放在有足夠幼魚孵化后離開的孔的網或架子上。巴斯德移液管的用處是適當地將胚胎和幼苗移到半穩態實驗中并每日都重復（見章節）。在大容器中放有卵的格子或網是卵的容器。這些限制可以在幼

7、苗孵化后移除，但要保留一些以阻止魚逃跑。如果有需要遷移幼苗，它們就不能暴露在空氣中且網不應用來將魚從卵容器中放出來（對于一些易碎種類如鯉魚，這個警告不必要）。對于這個遷移而安排的時間隨種類而改變而且遷移并不一定是必要的。對半穩態技術，如必要也可使用燒杯或淺底容器，并在其底部上方裝一個紗網且比燒杯底略微提高一點。如果這組容器足夠滿足裝樣要求，那遷移胚胎和幼苗是沒必要的。 水類似列在附件4的符合可接受的稀釋物的化學性質的任何水和那些在附件2、3中描述的可以且可能好的展示實驗效果的水都是合適的實驗用水。在整個實驗過程中水的性質要不變。而pH則只能在單位內波動。為保證稀釋水不會不正當地影響實驗實驗結果

8、（例如與實驗物質生成配位化合物），或反之影響繁殖用的卵的演示。在不同區間取樣進行分析。重金屬（如Cu、Pb、Zn、Hg、Cl、Ni）、主要的陰離子、陽離子（如Ca2+、Mg2+、K+、Cl-、SO42-）、農藥（如全部含磷、含氯的有機物）、全部含碳有機物和懸浮的土壤的含量都要準備好。例如每3個月測定一次以保證稀釋水的性質是不變的。如能證明水質至少一年保持不變，測定可以不必太頻繁，周期可長一些（如每6個月一次）。 實驗溶液選擇濃度的實驗方法是由繁殖溶液的稀釋來決定的。單純地通過機械方式（如攪拌機和超聲波）簡單的混合或搖動實驗物質可以更好地為繁殖溶液做準備。飽和柱（溶解柱）可用來完成一個濃縮的繁殖

9、溶液。盡可能地避免使用溶劑或分散劑（溶解藥劑）。盡管如此，在一些情況下也可用該類物質制備適合繁殖的合適濃度的儲備液，的例如丙酮、乙醇、甲醇、DMF、和三甘醇二甲醚都是較好的溶劑。而cremophor RH40、Tween 80、0.01%甲基纖維素和HCO40是較好的分散劑。當使用易為生物分解的藥劑（如丙酮）和那些在流通實驗中因易揮發而導致細菌組合出問題的藥劑時要特別注意。當使用一種溶解劑的時候，它絕對不能對魚的生存構成威脅或產生在早期生命時期可觀測到的不利影響。盡管如此，在使用類似材料時盡可能避免產生任何影響。對半穩態技術，要進行2個不同的重復步驟(i)要么為新的實驗準備干凈的容器并在不接觸

10、空氣條件下將生存的卵和幼苗從原來的舊溶劑中遷移到新容器；(ii)要么將有機體保持在容器中同時換一定比例（不少于3/4）的實驗用水。更新的頻率取決于實驗物質的穩定性但每天換水是必要的。如果通過初步穩定性實驗發現實驗物質濃度再更新期間不能穩定（即：超出標準濃度80%120%的范圍或低于80%），則考慮使用流通法進行實驗。無論如何，在水更新操作要小心，以免壓迫幼苗。對流通性實驗，需要一個能持續分配、稀釋繁殖溶液的系統（如測量泵，比例稀釋器，飽和系統）來制備一系列濃度的展開槽。繁殖溶液和稀釋水的流速要在每日不同時間段控測并且在全部實驗中變化不超過10%。一個合適的流速要求在24小時中流過至少5個實驗展

11、開槽（2）。17 測定步驟魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實驗演示中的有效信息在文獻中可查得。一些例子可在文獻（7）、（8）、（9）中查得。 暴露條件 持續時間這個實驗最好在卵受精后30分鐘內開始。在胚盤分裂初期或胚囊初期前后將胚胎浸入實驗溶液。對于大量獲得的卵不可能在受精后立刻開始實驗。推遲實驗會嚴重影響實驗的敏感度。這個實驗應在受精后8小時開始。在暴露期幼苗禁止喂食。實驗終止于任一幼蟲將卵黃完全吸收光為止或餓死率超出對照之前。持續的時間長短取決于使用的材料種類。在附件2、3中給出了可接受的持續時間。.2裝樣在實驗開始前受精卵的數量應當足以達到統計要求。它們應隨機分布在整個系統中。并且30個受精

12、卵，平均分配到至少3個同樣的實驗擴展槽中，應當使用在每一濃度而裝樣比率（每份實驗溶液的生物量）應當足夠低到可以溶解的氧氣濃度在通風環境下至少保持占60%ASV（美國標準）。對流通法來說，裝樣比率不超過24小時0.5g/L，而且要求無論何時對溶液說不超過5g/L。.3光照和溫度光照時間和實驗水溫要適合所實驗的種類（附件2、3），使用溫控儀的目的是，它可以在附加實驗容器上使用。 實驗濃度一般地，要求5組實驗物質濃度間隔恒定在不超過3.2。在選擇實驗濃度的范圍時，要考慮相關的LC50對光照時間的曲線。在一些條件下，少于5個濃度如一些限制實驗或一個更狹小的濃度區間的用處是適當的。如果少于5個濃度，則要

13、提供理由。物質濃度要高于96小時 LC50或100mg/L，低于任何一個則無須測定。在測定中水中物質高于它們溶解度則不予實驗。當使用一種溶劑（或分散劑）（見章節）時，它的最終濃度不應該高于0.1mg/L并且應在所在實驗容器中保持一致。 對照實驗稀釋水的對照實驗（適當濃度）和如有關的溶劑含量（盡量重復）的對照實驗應當在除實驗進程之外時進行。化學分析中測定和測量的頻率在整個實驗過程中，實驗物質的濃度是由規定的區間來決定的。在半穩態實驗中，希望實驗物質的濃度浮動在標準范圍20%上下（即：在80%120%范圍內；見章節 1.4和1.6）。最低限度要求在新準備的和即將更新時的最高和最低實驗濃度要在至少3

14、個不同分開的場合進行分析（即：再更新準備和在更新時，要對相同溶液的試樣進行分析）。對于那些實驗物質濃度無法預計是否在正常范圍內20%（在實驗物質穩定的基礎上），就必須在新準備的和即將更新時的最高和最低實驗濃度進行分析，但要保證同一種方法（即：整個實驗至少平等的在3個平分的區間）。更新開始時實驗物質濃度的測量需要在重復的容器內每次測量濃度。測量在分開的7天內進行。要求實驗實驗結果建立在精確的濃度上。盡管如此，如果有適當證據證明，溶液內實驗物質濃度很好的穩定在標準的或實驗全程初濃度的20%，那實驗結果也可以在標準或精確的初始值上得出。對流通性實驗，對半穩態實驗所描述的類似采樣方式是合適的（但這種情

15、況下“舊的”溶液的測量方法是不適用的）。盡管如此，如果實驗持續時間大于7天，在第一周增加采樣場合的數量（如每3組）來保證實驗濃度穩定是適當的。樣品要被離心或過濾（如用孔徑0.45µm）。盡管如此，然而無論離心還是過濾都不能將實驗物質中非生物適用部分分開，樣品也不必受這些條件約束。在整個實驗中，溶解的氧氣，pH，溫度要在所在容器中精確測量，對照實驗中的溫度和最高濃度的容器中總硬度和鹽濃度也要精確測量。至少，溶解的氧氣和鹽濃度要測量3次（開始，中間，結束）。在半穩態實驗中，溶解的氧氣要更精確的測量，最好在每次更新水前后或至少1周1次。硬度則每次實驗測一次。溫度應天天測量且最好在至少1個實

16、驗容器中繼續控測。 觀測.1 胚胎生長期盡可能證明胚胎期（如胚囊期）在開始就暴露在實驗物質中。這樣做是為了更好的保養好卵樣品。而幼生期的例子及描述的文獻可在文獻（2）、（5）、（10）、（11）查找到。.2 孵化和繼續生存孵化和繼續生存的觀測每天至少記錄一次，而在實驗初期（在前3個小時則每30分鐘）提高觀察頻率是可取的，而在一些情況下幸存時間比死亡數目更有意義（如：有劇烈毒性影響時）。死去的胚胎和幼苗一旦腐爛就要迅速移除。在移除死亡個體時要千萬小心，別碰到附近的卵和幼苗或對其造成物理損傷，死亡標準依不同生命階段而改變：對卵： 特別是早期，早期的半透明著色的明顯損失和改變，由蛋白質凝固或沉淀導致

17、的白色渾濁（不透光）物。對胚胎：身體移動的終止和心跳消失，及半透明胚胎上有不透光的一系列污點出現對幼苗：靜止不動或呼吸消失，心跳停止或中央神經系統有白色不透光污點出現或缺乏對機械刺激的反應。.3 異常跡象大量幼魚在身體上的色素沉著反常，而卵黃吸收期有足夠的取決于實驗持續時間和描述的反常現象的性質所取得區間被記錄下來。應當對那些自然出現的反常的胚胎和幼苗小心觀察，也應記下對照實驗中那些規則的百分比次序。反常的動物死后應從容器中移除。.4 反常行為在由實驗持續時間所決定的足夠區間中，那些反常，如換氣過度、不協調的游動和不正常的休眠要記錄下來。這些影響，盡管數量不同，在觀察時可以增加致死數據的說明即

18、提供了實驗物質的毒性反應信息。.5 長度在實驗結束，要測量每個個體長度。標準長、股長或全長均可。如果尾鰭腐爛或鰭上有腐蝕，可使用標準長度。一般地，在一個運行良好的實驗中，重復對照實驗時長度的系數變化應小于20%。.6 重量在實驗結束，要測量每個個體重量。干重（在60下24小時）比濕重好。一般地，在一個運行良好的實驗中，重復對照實驗時重量的系數變化應小于20%。以下這些項目將在一些或全部用來作統計分析：累積死亡率；實驗結束后健康幼苗數；開始孵化和孵化結束的時間（即：在每個重復實驗中有90%孵化）；每天孵化幼苗數；實驗殘存者的長度（和重量）；畸形或反常現象的幼苗數量；展示出反常行為的幼苗數量。2.

19、 數據和實驗結果報告2.1 實驗結果處理因方法要求考慮實驗方法的改變如實驗擴展槽的數量、濃度的數量、受精卵的數量和參數的測定，所以要求一位統計員既計劃實驗又分析實驗。由于方案中一些適當的選擇，特定的關于統計步驟的指導這里不再給出。如果LOEC/NOEC會被預估，那對于每組重復實驗采用不同的分析方法或偶爾的表格法來變化的進行分析是必要的。為了對個體濃度和對照實驗的實驗結果做倍數比較，可以使用Dunnett的方法（12）、（13）。其他例子也是合適的（14）、（15）。使用ANOVA的可觀察影響的大小或其它步驟（即實驗的能力）應當被預測好并實驗結果報告。要注意不足所有在章節.6中列出的觀察項目適合

20、用ANOVA做統計分析。例如實驗結束時累積致死率和健康幼苗數量要用概率法分析。如果LC/Ecx被預先估測。合適的曲線，如類似的計算曲線，適合于使用統計方法如最小二乘法或非線性最小二乘法的數據。可以確定曲線參數以明確LC/Ecx并且可以直接指出它的明顯錯誤。而這可以非常容易計算出LC/Ecx周圍的置信限。除非有更好的選擇不同置信水平的原因，應引用雙側置信95%。適當的步驟能更好的提供一個評估缺乏擬合的重要性，可以使用適當曲線的圖解法。回歸分析對章節.6所有觀察物均使用。2.2 實驗結果說明實驗結果說明要告訴在實驗溶劑中以分析方法的水平限制下的測量的毒物濃度。對在溶解物質的水的上方的濃度實驗結果報

21、告說明也要詳細給出。2.3 實驗結果報告實驗結果報告必須包括下列信息：實驗物質物理性質和相關的物理-化學性質；化學鑒別數據，包括純度及對合適的實驗物質定量分析的方法；實驗種類學名，血統，親代魚類的數目（即實驗中有多少母魚用來提供所要求的卵），來源，受精卵的收集和隨后的利用。實驗條件習慣上的實驗步驟（例如：半穩態實驗，流通法，受精到實驗的時間段，裝樣等等）；實驗方案（例如：實驗擴展槽的數目，重復次數，每次重復胚胎數）；繁殖溶液的準備方法和更新的頻率（溶質及其濃度在使用時必須給出）；標準實驗濃度，測量值，測量方法和明確的容器及方法上的測量誤差，如果實驗物質溶解在水中的濃度小于已測的，要提供涉及到測

22、量實驗濃度的測量方法。溶劑水的性質：pH，硬度，堿度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度，殘余氯元素的級別（如已測），所有含碳有機物，懸浮的土壤，實驗環境的含鹽量和其他可測定的物質；容器水的性質：pH，硬度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度；實驗結果從實驗物質穩定性初步得到的實驗結果所有可接受的可對照的標準的實驗魚種證明（附件2、3）；每日胚胎和幼蟲死亡率/幸存者和全部的死亡率/生還率數據；孵化天數和孵化數目的數據；重量和長度的數據；畸形發生率及其描述；統計分析和數據處理；對使用ANOVA分析的實驗，對每個預估反應在p=0.05時的LOEC和NOEC，包括使用的統計步驟的描述和那些初查出影響的程度的跡象；對

23、用回歸分析的實驗，LC/Ecx和置信區間和適合計算的曲線模型。3參考文獻：(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, pp 60.June 1990.(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Ear

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38、80pp.(25) BLaxter J.H.S.91998).Pattern and variety in develll Eds., Fish Physiology,vol.XIA,Academic press pp1-58.表格 1A 實驗可接受的魚的種類淡水魚類Oncorhynchus mykissRainbow trout(9)(16) 虹鮭Danio rerioZebrafish(7)(17)(18) 斑馬魚Cyprinus caprioCommon carp(8)(19) 鯉魚Oryzias LatipesJapanese ricefish/medaka(20)(21)PimepH

39、aLes promeLasFathead minnow(8)(22)表格 1B 一些其它文獻曾用過的種類淡水咸水Carassius auratus金魚Menidia peninsuLae潮水 最好的牛腿肉(23)(24)(25) Lepomis macrochirus淺藍色食用大太陽魚CLupea harengus鯡魚（24）（25）Gadus morhua鱈 (24)（25）Cyprinodon variegatus紅鱸 鯉科小魚(23)(24)(25) 附件 1在一個毒性測定對胚胎及 SACFRY 的表現方面的指導引言斑馬魚起源于印度 Coromandel 海岸高速流動的河流中。它是鋰魚家

40、族一類通常的水族館魚，有關它培育和照料方式的信息能在熱帶魚的權威參考書中查到。LaaLe曾研究過它在漁場研究方面的理論和應用（1）。魚體長度很少超過 45 毫米。魚體是圓柱形并帶有7到9條深藍色的斑紋，與銀色相間，這些斑紋延伸到尾部至尾鰭處。 背部是橄欖綠色。雄性較雌性個體為小。而雌性更帶銀色的，且腹部更大, 顯然這有利于產卵。成魚能夠忍受溫度， pH 和水硬度的較大變動。 然而,為了使魚體健康而產出高質量的卵,應提供最佳的生存條件。在發情期間雄魚四處找尋雌魚然后以頭對著雌魚, 這樣當卵產下后便已受精。卵是透明的，且彼此是相互獨立的, 當它們沉到底部時就有可能被父母吃掉。產卵受陽光影響。如果早

41、晨陽光足夠的話,雌魚通常會在黎明之后的幾小時就產卵。每只雌魚一次可產下幾百粒卵，每兩次產卵間隔一個星期。親代魚的情況,繁殖及早期發育階段選擇適當數量健康的魚，然后讓這些魚在條件適宜的水中(例：附4)生活，要求在預計的產卵期前必須生活至少2周以上。這批魚在本次研究以前必須至少產過一次卵。魚群的密度在此期間不得超過1克每升。在有規律的換水或是水體凈化可以允許種群密度高一點。培養箱的溫度應該維持在25±2，并提供各種各樣的魚食，例如，適當的商品性干食物，或是新鮮的 hatched Arthemia, chironomids(搖蚊),Daphnia（水蚤），白色蚯蚓(Enchytraeids

42、)。兩個過程在下面有所描述, 這導致有一批健康的受精卵以保證測定：8條雌魚和16條雄魚同放在一個包含50升已稀釋培養液的桶里,避免受陽光直射且盡可能不受打擾的保持至少48個小時。在開始測定的前一天下午把一個產卵托盤放在魚缸的底部。這個產卵托盤由plexi-glass(聚異丁烯酸樹脂)或其它合適的材料組成一個框架，5到7cm高，一個2到5mm的粗糙的網連到頂部，同時一個10到30微米的網在底部。大量由解開的尼龍繩組成的產卵樹附在那個粗糙的網上。當魚已被留在黑暗中12個小時之后，一束微弱的光線就會導致開始產卵。產卵后二到四個小時，移開產卵托盤并收集產的卵。產卵托盤作用在于可以防止父母吃掉卵同時使收

43、集這些卵變得容易。這些產卵的魚在用于本次實驗前必須至少已產過一次卵。在預產期前至少兩周把5到10條雄魚和雌魚隔離放置。5到10天后，雌魚的腹部變大而且可以看到它們的生殖器乳頭。雄魚則沒有乳頭。產卵就在這個底部裝有偽裝網（如上所說）的產卵缸內進行。這個產卵缸裝滿了作為溶劑的水，因此在底部網以上的水深為5到10cm在預產期前一天把一條雌魚和兩條雄魚放在缸里面，控制水溫在最適合溫度再高一度。屏蔽所有的光線并把缸放在盡量不受打擾的地方。早上的一絲光線就會誘發產卵。2到4小時后，移開魚并收集卵。如果卵的需求量很大，一條雌魚產的不夠多的話，就應該同時培養幾個產卵缸。通過記錄這些優于測定（數量和質量）的成功

44、產卵經歷，這些有著高產卵成功率的雌魚就會被挑選出來飼養。這些卵會被轉移到一個由玻璃管（內徑不小于4mm)組成的測定容器里,并提供一個柔和的抽氣球。在測定容器內的水要盡可能的少。卵密度比水的大因此會下沉而落出管子，此時要小心注意不讓卵（以及幼蟲）接觸空氣。在這些卵中作抽樣微型試驗來保證在這第一個發育的階段里面所有卵都是一樣好的。對這些卵不準消毒。在受精后的24小時里卵的死亡率是最高的，一般會達到5%到40%。如果卵腐敗就代表受精或發育失敗。一批卵的質量看起來似乎是由雌魚決定的，因為一些雌魚總是產下高質量的卵，而另一些卻相反。同樣發育率和孵化率也是因雌魚不同而異。成功的受精卵以及卵黃囊幼蟲發育得好

45、，一般可達到90%。在25攝氏度時受精卵會孵化3到5天然后卵黃囊會在受精后的約13天里被吸收。Hisaoka 和 BattLe（2）曾對胚胎的發育作過詳細的定義。從卵和發育幼蟲的透明度可以看出哪些會發育成為魚以及哪些會發育為畸形。大約在產卵后4小時，未受精的卵就可以從受精卵中區別出來（3）。因為這個原因，卵和幼蟲會被放置到一個小容量的測定器皿里面，這樣就可以用顯微鏡來觀察。早期發育階段的試驗條件，在附錄2里列出。理想的試驗環境的pH值和水硬度分別是7.8和250 mg CaCO3/L 。計算和統計建議分兩步進行。第一，死亡率，畸形發育和孵化時間應被統計分析。然后，在那些對上述統計項沒有任何影響

46、的濃度上，魚體的平均長度可以通過統計求出。這個步驟是可取的，因為毒素可以有選擇性的殺死小魚，延遲孵化時間并使畸形魚量增大，因此導致平均魚體長度的測量值偏差。此外，每次測量的魚數目相同，這樣也保證了統計數值的有效性。LC50 及 EC50 定義平安生存下來卵和幼蟲的百分比和修正后的死亡率符合 Abbott 公式(4)：其中 修正后的存活率 試驗中集中觀察到的存活率C 控制下的存活率如果可能的話, 在試驗結束的時候LC50 已被一個適當的方法決定。如果在EC50 的統計中試驗的畸形率與期望值差不多，可在StepHan(5)中得到指導。LOEC 和 NOEC估計一個客觀的卵和 sac-fry試驗是為

47、了與受控的非零集中相比較，即決定了LOEC.因此多方面的比較方式應被采用。參考文獻(1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) inFisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hami

48、Lton-Buchanan) J. MorpH., 102, pp 311.(3) NageL R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydaniorerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp 173-181.(4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp 1-333

49、.(5) StepHan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp 69-81.(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing SeveralTreatments with a Control. J. Amer. Statist. A