1、細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的制備及其抗菌性能研究摘 要：細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose, bc）是一種由微生物合成的高純度纖維素，超細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使其具有高比表面積、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被認(rèn)為是一種潛在的“理想”醫(yī)用敷料材料。然而，細(xì)菌纖維素本身不具有抗菌性能，難以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的傷口。納米銀是一種廣譜抗菌劑。因此本文以細(xì)菌纖維素為模板，采用環(huán)境友好的化學(xué)還原劑抗壞血酸為還原劑，原位制備細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料。同時(shí)分別采用抑菌圈法和最小抑菌濃度法對(duì)復(fù)合物的抗菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。關(guān)鍵詞：細(xì)菌纖維素 納米銀 抗菌 創(chuàng)傷敷料一、引言細(xì)菌纖維素是一種由微生物

2、合成的高純度纖維素，其微纖維直徑只有40-60nm，是自然界中天然存在的精細(xì)納米材料。超細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使其具有高比表面積、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被稱作“大自然賦予人類的天然生物醫(yī)用材料”1。大量研究和臨床試驗(yàn)表明，細(xì)菌纖維素基創(chuàng)傷敷料對(duì)于燒傷燙傷以及慢性潰瘍疾病具有良好的治愈效果，是一種極具潛力的“理想”創(chuàng)傷敷料材料2。然而，細(xì)菌纖維素本身不具有抗菌性能，難以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的傷口。金屬銀及其化合物是目前最常用的無機(jī)抗菌劑，尤其適用于治療燒傷燙傷以及慢性潰瘍創(chuàng)傷3。因此，以細(xì)菌纖維素為載體負(fù)載納米銀粒子將有望獲得具有高效保濕抗菌功能的“理想”醫(yī)用創(chuàng)傷敷料。孫東平等以細(xì)菌纖維

3、素為載體，甲醛為還原劑采用液相化學(xué)還原法合成載銀細(xì)菌纖維素復(fù)合材料，所得銀納米粒子平均粒徑在45nm左右，對(duì)大腸桿菌、酵母菌和白色念珠菌等都有理想的抗菌效果4。marques等分別以細(xì)菌纖維素和普通植物纖維為基體，采用nabh4原位還原agno3的方法在纖維素膜上合成納米銀單質(zhì)，結(jié)果表明細(xì)菌纖維素纖維的銀負(fù)載量可達(dá)到植物纖維的50倍以上，并且對(duì)ag+具有更持久的控釋作用，是一種良好的納米銀合成基質(zhì)5。上述研究大多采用nabh4、甲醛等化學(xué)試劑為還原劑，這些試劑通常具有較高的人體毒性，反應(yīng)結(jié)束后很難解決試劑在纖維膜內(nèi)的殘留問題，尤其不適合應(yīng)用于生物醫(yī)用材料產(chǎn)品的制備。據(jù)此，我們提出，以細(xì)菌纖維素

4、為模板，摒棄有毒化學(xué)還原試劑，采用環(huán)境友好的抗壞血酸為還原劑，原位制備細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料木醋桿菌（acetobacter xylinum）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。agno3、抗壞血酸購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其它試劑若無特殊說明，均為市場(chǎng)可售。（二）細(xì)菌纖維素膜的制備和純化以木醋桿菌為菌種，將活化后的菌種接種至種子培養(yǎng)液中，在30和160rpm的搖床中培養(yǎng)24h。按6%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8 d，得細(xì)菌纖維素膜。培養(yǎng)基組成為麥芽糖25g/l，蛋白胨3g/l，酵母浸膏5g/l，ph值為5.0，121滅菌20 min。將bc膜取出

5、用去離子水反復(fù)沖洗，再浸泡于0.1%的naoh溶液中以去除細(xì)菌纖維素膜中的菌體及殘留培養(yǎng)基，80處理6h至膜呈乳白色半透明。最后用去離子水充分洗滌，直至洗液成中性。（三）細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的制備將上述bc膜浸泡于一定濃度的硝酸銀溶液中，在30恒溫水浴鍋中100rpm震蕩12h。然后將膜取出放入10mm的抗壞血酸溶液中，在磁力攪拌下冰浴還原6h。然后取出用去離子充分洗滌，得細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料。（四）含銀量的測(cè)定將制備的復(fù)合物樣品干燥后剪碎，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量溶解于hno3溶液中。采用原子吸收法測(cè)定其銀含量。（五）抗菌性能的測(cè)定（1）抑菌圈法以金黃色葡萄球菌為模型菌。具體方法為：將金

6、黃色葡萄球菌從斜面接種到種子培養(yǎng)基中，37恒溫培養(yǎng)12h得種子液。吸取0.1ml種子液至固體平板培養(yǎng)基上，涂布均勻。將載銀細(xì)菌纖維素膜平鋪在平板中央，37恒溫倒置培養(yǎng)24h。然后測(cè)量其抑菌圈大小，并以不載銀的純細(xì)菌纖維素膜為對(duì)照組。抑菌帶寬度定義為：抑菌帶半徑平均值與樣品膜半徑平均值之差。（2）最小抑菌濃度法（mic）以金黃色葡萄球菌為模型菌，采用mic法定量評(píng)價(jià)復(fù)合物的抗菌效果。具體方法為：將10個(gè)滅菌的含一定量培養(yǎng)基的三角瓶分別編號(hào)1-9號(hào)，在培養(yǎng)基中放入1-9片載銀細(xì)菌纖維素膜制成不同含銀量培養(yǎng)基。然后，取107cfu/ml的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml接種于上述1-9號(hào)三角瓶中，于3

7、7恒溫培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別從上述三角瓶中取出0.1ml培養(yǎng)液，將其涂布到瓊脂平板上，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，于37恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。以不長(zhǎng)菌的最低濃度為最小抑制濃度（mic）。三、結(jié)果與討論（一）細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的制備目前化學(xué)法還原制備納米銀粒子大多采用nabh4、甲醛等化學(xué)試劑為還原劑，這些試劑通常具有較高的人體毒性，反應(yīng)結(jié)束后需解決試劑在纖維膜內(nèi)的殘留問題，不適合應(yīng)用于生物醫(yī)用材料產(chǎn)品的制備。抗壞血酸是一種常用的醫(yī)藥原料，具有一定的還原能力。因此本文嘗試以抗壞血酸為還原劑，細(xì)菌纖維素為模板，原位還原制備納米銀。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，

8、細(xì)菌纖維素膜由初始的透明色逐漸變?yōu)榱咙S色，表明納米銀粒子在細(xì)菌纖維素膜上形成（圖1）。（二）含銀量的測(cè)定分別選用1.0、2.5及5.0mm的硝酸銀溶液制備細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料，采用原子吸收法測(cè)定不同硝酸銀溶液濃度條件下復(fù)合物的載銀量情況，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，隨著硝酸銀濃度的升高，復(fù)合膜的含銀量增加。但當(dāng)硝酸銀濃度大于2.5mm時(shí)，繼續(xù)增加硝酸銀濃度，復(fù)合物的載銀量幾乎不變，這說明此時(shí)可能達(dá)到了細(xì)菌纖維素膜的最大銀負(fù)載量。（三）抗菌活力的評(píng)價(jià)首先采用抑菌圈法對(duì)細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的抗菌活力進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。分別考察了上述三種硝酸銀溶液所制備的復(fù)合物的抗菌效果（圖3）。如圖所示，復(fù)合

9、物產(chǎn)生的抑菌圈的變化趨勢(shì)與其載銀量相似，這說明復(fù)合物載銀量的高低與抑菌圈寬度有一定相關(guān)性，即載銀量越高，抑菌圈越大。采用最小抑菌濃度法定量評(píng)價(jià)細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的抗菌活力，如圖4所示。由結(jié)果可知，當(dāng)硝酸銀濃度為1.0mm時(shí)，mic值最低，說明該制備條件下，復(fù)合膜的抗菌效果最好。在較高的硝酸銀濃度條件下，由于較高量的銀粒子負(fù)載到細(xì)菌纖維素膜上，可能會(huì)產(chǎn)生銀粒子團(tuán)聚，進(jìn)而影響其抗菌效果。四、結(jié)論本文以細(xì)菌纖維素為模板，抗壞血酸為還原劑，原位制備細(xì)菌纖維素/納米銀復(fù)合材料，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在較低的硝酸銀濃度條件下，所得復(fù)合膜的載銀量較低，抑菌圈較小，但其最小抑菌濃度值較低。

10、這可能是由于較低的銀負(fù)載量減弱了銀粒子的團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致其抗菌效果較好。基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金項(xiàng)目（no.21004008）；上海市教育委員會(huì)和上海市教育發(fā)展基金會(huì)“晨光計(jì)劃”項(xiàng)目（no.11cg35）。參考文獻(xiàn)1czaja w,krystynowicz a,bielecki s,brown r m.microbial cellulosethe natural power to heal wounds.biomaterials,2006,27:145-151.2alvarez o m,patel m,booker j,markowitz l.effectiveness of a biocellu

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