1、激光機器對光化學(xué)法模版的運用探索     作者：盧寶全 尚小明 楊峰 韓德昌 李相春 洪軍 單位：唐山工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 唐山工人醫(yī)院心內(nèi)科 河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 唐山工人醫(yī)院核磁共振室動物模型的制作將大鼠稱重，按照0.3mL/100g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，利用立體固定架前端的門齒環(huán)以及雙側(cè)的耳釘，對大鼠頭部進行固定。之后沿頭正中線切開皮膚，長度約1.5cm，分離暴露顱骨，以矢狀縫左側(cè)3mm，冠狀縫后3mm為中心，磨鉆打開直徑約5mm的骨窗，保留硬腦膜。C組僅鉆透顱骨的外板及板障，保留內(nèi)板并打磨平整。除A組外，按照30mg/kg劑量于尾靜

2、脈注入3.3%的玫瑰紅，持續(xù)時間約23min，隨后用冷光源或手持激光器照射目標區(qū)域，照射距離為3mm，照射時間依分組而定。照射結(jié)束后局部用慶大霉素鹽水沖洗，縫合頭部傷口，待生命體征恢復(fù)平穩(wěn)后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。動物觀測指標神經(jīng)功能的行為學(xué)評分參考Bederson5級分級法10，于術(shù)后24h、48h對各組大鼠進行神經(jīng)功能的行為學(xué)評分。頭部核磁共振(MR)掃描檢查于術(shù)后24h對大鼠頭部進行MR掃描，檢查前5min腹腔注射10%水合氯醛麻醉。單獨或24只同時固定于自制的泡沫板上，使用關(guān)節(jié)線圈對大鼠頭部進行掃描，掃描層面間距為2mm。腦梗死體積測定及病理學(xué)檢查術(shù)后48h大鼠麻醉后迅速開胸，剪開右心耳，從

3、左心室給予生理鹽水100mL灌洗，斷頭取腦，20冰箱凍保存20min。對于所取腦組織，用標尺在腦表面正中線以2mm等分，用病理切片機從視交叉前1mm左右冠狀位切腦，其后間隔2mm連續(xù)做6個冠狀切片。每組隨即抽取2個標本用于HE染色，其余用于腦梗死體積測定。腦梗死體積測定將所需標本放入2%TTC液，37下孵育20min(10min后翻面)，正常腦組織染成紅色，梗死灶染成白色。染色后置于4%多聚甲醛固定，24h后用Olympus數(shù)碼相機攝相后輸入電腦，應(yīng)用Imagine-proplus6.0版測量各層面的梗死面積，將梗死灶面積乘以層厚2mm得出每個層面的梗死灶體積，相加各層面的梗死灶體積即得出整個

4、腦組織的梗死灶體積。病理學(xué)檢查將所需的腦組織切片置于4%多聚甲醛固定24h以上，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后將腦組織切片，厚度約4m，3738水浴展片，普通載物片撈片，置60烤箱中1h，蘇木精伊紅染色，樹膠封片。模型制作成功率模型制作成功的條件:MR檢查及TTC染色可見梗死灶形成，或得到光鏡下病理觀察驗證;模型制作后24h內(nèi)出現(xiàn)過神經(jīng)行學(xué)異常;未出現(xiàn)血腫及其它嚴重并發(fā)癥，48h內(nèi)存活。同時滿足以上條件者為模型制作成功，除以同組大鼠的數(shù)目即為模型制作成功率。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0forwindows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，當差異具有顯著

5、性時(P0.05)，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗來分析組間的差異。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x珋±s)表示，各組間的比較用單因素方差分析，兩組間率的比較用2檢驗，必要時用Fisher確切概率法。P=0.05為顯著性檢驗水準。光照強度穩(wěn)定性測定冷光源光照度為7.20±0.67×103勒克斯(Lux)，手持激光器的光照度為(1.29±0.11)×105Lux，后者是前者的18倍。光照度變異系數(shù)冷光源為9.3%，手持激光器為8.5%，并無顯著性差異(P=0.53)。一般情況及神經(jīng)行為學(xué)評分48h內(nèi)36只大鼠無死亡出現(xiàn)。麻醉清醒后

6、，大鼠精神萎靡，活動及攝氏減少，術(shù)后24h神經(jīng)行為學(xué)評分多在2分以下，C組有兩只大鼠評分達到3分，后證實為合并硬膜外血腫。術(shù)后24h神經(jīng)行為學(xué)評分，各組間存在顯著性差異(P=0.000)，進一步進行兩兩比較，顯示A組與B組、A組與C組、D組與B組、D組與C組之間存在顯著性差異(P0.05)。48h后神經(jīng)行為缺損多有明顯好轉(zhuǎn)，各組間神經(jīng)行為學(xué)評分無顯著性差異(P=0.2)頭部MR掃描情況術(shù)后24h頭部MR掃描顯示，A組未見腦梗死形成，B組、C組全部有腦梗死灶形成，D組僅部分大鼠形成梗死灶，但體積明顯較B、C、小。另外C組有2例合并硬膜外血腫(圖1)。TTC染色梗死體積測定TTC染色可見正常腦組織

7、著深紅色，梗死腦組織呈白色(彩插4圖2)。A組未見梗死灶形成，B組、C組全部于左側(cè)照射區(qū)形成部位恒定的梗死灶，局部腦組織蒼白、腫脹明顯，冠狀面成“碗型”，尖端指向側(cè)腦室，深達皮質(zhì)全層，體積為B組16.7±3.23mm3，C組15.6±2.85mm3，二者間無顯著性差異(P0.05)。D組僅部分形成梗死灶，且體積(5.2±1.96mm3)明顯小于B組、C組(P0.01)。2.5腦組織病理學(xué)檢查A組大鼠光鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)規(guī)整，細胞核完整。大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞層次清晰，神經(jīng)元邊界清，錐體細胞突起明顯，胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻、色淡，核仁清晰、染色較

8、深，胞漿無水腫表現(xiàn)，內(nèi)皮細胞及周圍間隙形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。B組、C組大鼠腦標本鏡下觀察，HE染色可見病灶與周圍組織分界清楚，梗死灶內(nèi)腦組織軟化，細胞碎裂，胞漿液化，核固縮或偏位，細胞溶解后形成的格子細胞等。神經(jīng)元呈不同程度的缺血性改變，腫脹的神經(jīng)元胞漿淡染，呈圓形或橢圓形，皺縮的神經(jīng)元染色深，胞體小，呈三角形。許多神經(jīng)元外形不易辨認，大部分細胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性。病灶中心微血管內(nèi)血栓形成及淤血，壞死邊緣區(qū)可見中性粒細胞浸潤。D組的兩只大鼠之中一只存在小的梗死灶，另一只未見異常。模型制作成功率比較B組、C組、D組模型制作成功率分別為100%、80%、50%，將B組、C組合并為手持激光器組，與冷光

9、源組(D組)比較，經(jīng)確切概率法驗證，兩種方法間有顯著性差異(P=0.026)。目前局灶性腦梗死模型制作時需要結(jié)扎動脈或機械性阻塞遠端血流，創(chuàng)傷大，且技術(shù)操作具有一定難度，一些學(xué)者開始探索相對簡單的局灶性腦缺血模型。方法之一是在顱內(nèi)注射血管收縮物質(zhì)如內(nèi)皮素，以造成局部缺血11。這種方法已在大鼠得到重復(fù)驗證，但在小鼠上制作時，則需結(jié)合其他藥物注入或血管結(jié)扎才能形成梗死灶12。另外，此方法雖然簡便，但形成的缺血灶部位不確切，而且死亡率并不低。光化學(xué)法制作腦梗死模型由Watson等13于1985年首次報道后，已得到廣泛應(yīng)用14，15。其原理是由注入動物體內(nèi)特殊的光敏物質(zhì)即光敏劑，在特定波長的光源照射下

10、，誘發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生并釋放活性氧自由基，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損害，引發(fā)血小板聚集粘附，形成血管內(nèi)血栓，閉塞血管，導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，最終發(fā)生不可逆組織損傷。光化學(xué)法腦梗死動物模型的制作，光敏劑和照射光源是兩個主要條件。玫瑰紅B是迄今已知最強的光敏劑，其最大吸收波長為549nm。照射光源國內(nèi)多應(yīng)用冷光源，配合濾光片，光導(dǎo)纖維輸出單色光，照射時間830min不等9，16，17。為提高照射效果，我們將冷光源照射時間設(shè)定為40min，模型制作成功率仍低于手持激光器組，且腦梗死體積多小于預(yù)期。其原因可能為玫瑰紅B雖為強光敏劑，但所需光照強度大，自制的冷光源輸出的光照度低，僅為手持激光器的1/18，雖增加

11、時間仍難以滿足需要。而手持激光器不僅光照度高，我們所進行的穩(wěn)定性測定，也證明了短時間內(nèi)穩(wěn)定性強，不會很快出現(xiàn)光照強度衰減的現(xiàn)象，相信隨著大容量充電電池的應(yīng)用，其光照強度可以在較長時間內(nèi)保持，更加適合于實驗研究。另外，該研究中不注射光敏劑的A組，手持激光器照射5min并未引起局部組織腫脹、壞死，也說明了其安全性，但更長時間的照射是否安全需要進一步驗證。在光化學(xué)法局灶性腦梗死模型制作過程中，一般需要開骨窗，即去掉顱骨，暴露硬腦膜。但有報道不破壞顱骨或者僅僅去掉顱骨的外板和板障，保留內(nèi)板，適宜光源照射后同樣可以制成局灶性腦梗死模型18，19，我們對此也進行了驗證，發(fā)現(xiàn)確實可以在照射方向形成局灶性梗死

12、灶，但少數(shù)大鼠合并出現(xiàn)硬膜外血腫，考慮其原因可能為:顱骨內(nèi)板與硬腦膜之間存在大量的橋靜脈，光化學(xué)反應(yīng)后同樣可以形成血栓，阻塞血流，淤血致一定程度引起靜脈破裂出血，從而造成硬膜外血腫。因此建議模型制作時去掉顱骨為宜。由于該模型為皮層腦梗死，損害部位僅為皮質(zhì)感覺運動區(qū)，皮質(zhì)下紋狀體、海馬和丘腦未受損，加之大鼠強大的回復(fù)能力，大鼠神經(jīng)行為學(xué)異常輕微，尤其48h后與無損傷組差異已不顯著，提示在該模型中不宜將神經(jīng)行為學(xué)評分作為干預(yù)因素效果的較長時間觀測指標。即使在經(jīng)典線栓法制備的局灶性腦梗死模型(大腦中動脈栓塞)中，王志強等20研究認為大鼠的肢體運動功能與腦梗死體積并無相關(guān)性，48h內(nèi)肢體運動功能正常的大鼠并不一定不形成梗死灶，同時造模術(shù)后沒有梗死灶的大鼠，也不一定完全沒有神經(jīng)功能缺損癥狀。因此，模型制作成功與否需結(jié)合術(shù)后大鼠的神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色后的腦梗死體積、腦組織病理切片的鏡下觀察等方面進行綜合界定。為便于活體判斷，我們又加入了MR掃描檢查，但由于顯示清晰度原因，未作定量分析(梗死面積或體積計算)，僅作為定性判斷。相比較其它模型制作方法，光化