1、0102結核病實驗室檢查及意義結核病實驗室檢查及意義目錄目錄01. 01. 分枝桿菌概述分枝桿菌概述02. 02. 結核病實驗室檢查結核病實驗室檢查03. 03. 小結小結2分枝桿菌概述分枝桿菌概述013分枝桿菌屬分類分枝桿菌屬分類結核分枝桿菌(M.tuberculosis)非結核分枝桿菌（NTM）麻風分枝桿菌（M.leprae）4結核分枝桿菌的發現結核分枝桿菌的發現1882年年 德國柯赫醫生發現結核致病菌德國柯赫醫生發現結核致病菌-結核桿菌結核桿菌5結核桿菌的變遷結核桿菌的變遷1897年提出結核病的飛沫傳播年提出結核病的飛沫傳播1922年，卡介苗為預防結核病年，卡介苗為預防結核病首次對新生兒

2、接種首次對新生兒接種1945年，鏈霉素的問世使肺結年，鏈霉素的問世使肺結核不再是不治之癥。核不再是不治之癥。6結核分枝桿菌結核分枝桿菌特點特點(M.tuberculosis)生物學主要特點：生物學主要特點：1. 細胞壁中含有大量細胞壁中含有大量脂質脂質2.引起的疾病都呈引起的疾病都呈慢性慢性并并伴肉芽腫伴肉芽腫3.抗酸染色陽性抗酸染色陽性7結核病結核病 由結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病由結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病8結核病結核病臨床表現臨床表現癥癥 狀狀 體體 征征 1.全身癥狀：消瘦、全身癥狀：消瘦、盜汗、低熱、乏力盜汗、低熱、乏力2.呼吸系統癥狀：咳呼吸系統癥狀：咳嗽、約嗽、約1/3

3、咯血咯血3結核變態反應結核變態反應表現表現因肺結核好發于因肺結核好發于肺上葉尖后段及肺上葉尖后段及下葉背段，故鎖下葉背段，故鎖骨上下、肩胛間骨上下、肩胛間區叩診音濁區叩診音濁9結核病發病機制結核病發病機制起始起始期期細胞外增殖期和傳播期細胞外增殖期和傳播期共生期共生期T T細胞反應期細胞反應期10結核病發病機制結核病發病機制結核分枝桿菌通過飛沫進入呼吸道，被肺泡巨噬細胞吞噬殺滅結核分枝桿菌通過飛沫進入呼吸道，被肺泡巨噬細胞吞噬殺滅，不不留任何痕跡和感染證據。留任何痕跡和感染證據。特點：不存在結核桿菌復制，不存在免疫周圍細胞的免疫應答特點：不存在結核桿菌復制，不存在免疫周圍細胞的免疫應答起始期起

4、始期結核分枝桿菌在體內復制，形成感染灶，結核分枝桿菌在體內復制，形成感染灶，由由T T細胞介導的細胞免細胞介導的細胞免疫和遲發型變態反應，進一步清除細菌。疫和遲發型變態反應，進一步清除細菌。特點：激活體內免疫反應特點：激活體內免疫反應（CMICMI和和DTHDTH），宿主獲得抗結核抵抗力），宿主獲得抗結核抵抗力反應期反應期11結核病發病機制結核病發病機制 在在低氧、低氧、低低pHpH、抑制性脂肪酸和宿主免疫機制共同作用下抑制細菌的增殖。、抑制性脂肪酸和宿主免疫機制共同作用下抑制細菌的增殖。結核分枝桿菌未被完全清除，細菌和宿主處于共生狀態，結核桿菌主要存結核分枝桿菌未被完全清除，細菌和宿主處于共

5、生狀態，結核桿菌主要存在于壞死組織中央在于壞死組織中央。特。特點：可激發和維點：可激發和維持持T T細胞的免疫記憶，在一定條件細胞的免疫記憶，在一定條件下再次發病下再次發病共生期共生期長期休眠的結核細菌在一定條件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障長期休眠的結核細菌在一定條件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引，引起結核起結核病病特點：結核播散特點：結核播散增殖增殖傳播期傳播期12接觸活動性結核病患者接觸活動性結核病患者暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除- 沒有癥狀沒有癥狀, ,結核桿菌仍舊結核桿菌仍舊存在而不能存在而不能被檢測被檢測 - X-X-光光/ CT

6、 / CT 掃描顯示正常掃描顯示正常- 沒有抗體應答沒有抗體應答- 診斷困難診斷困難- 傳統的結核感染檢測只有傳統的結核感染檢測只有 TSTTST（PPDPPD）機體被感染機體被感染受機體免疫力抑制受機體免疫力抑制沒有臨床癥狀沒有臨床癥狀終身處于感染狀態終身處于感染狀態潛伏感染潛伏感染有臨床癥狀有臨床癥狀具有傳染性具有傳染性- 結核桿菌可以通過涂片、結核桿菌可以通過涂片、培養檢測出培養檢測出- 胸部的胸部的 X- X-光或光或 CT CT 掃掃描顯示異常描顯示異常 - 肺外結核難以診斷肺外結核難以診斷 ( (特別是兒童特別是兒童)活動性結核活動性結核5%5%再次激活再次激活活動性結核與潛伏感染

7、活動性結核與潛伏感染13結核病結核病診斷診斷實驗室檢查實驗室檢查影像檢查影像檢查病理檢查病理檢查+臨床臨床 指征指征14結核桿菌實驗室檢查結核桿菌實驗室檢查02結核診斷結核診斷-臨床應用臨床應用幾乎所有的臨床內科科室幾乎所有的臨床內科科室都需要結核的鑒別診斷：都需要結核的鑒別診斷：發熱待查，結核排篩發熱待查，結核排篩結腦的鑒別診斷結腦的鑒別診斷胸腹水患者待查胸腹水患者待查兒童結核兒童結核16結核桿菌結核桿菌結核病結核病實驗室檢實驗室檢查查細菌學檢查細菌學檢查免疫學檢查免疫學檢查分子生物學檢查分子生物學檢查分分枝桿菌分離培養枝桿菌分離培養分支桿菌藥敏試驗分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒分枝桿菌菌種

8、鑒定定體液免疫學診斷體液免疫學診斷細胞免疫學診斷細胞免疫學診斷DNA測序測序DNA探針技術探針技術聚聚合酶鏈反應（合酶鏈反應（PCR）17結核分枝桿菌結核分枝桿菌- -實驗室檢查實驗室檢查涂片鏡檢涂片鏡檢細菌學檢查細菌學檢查適用于多種標本；操作簡便，價格低廉。適用于多種標本；操作簡便，價格低廉。 2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性； 1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+肺部影像學檢查符合活動性肺結核表現。肺部影像學檢查符合活動性肺結核表現。肺結核治療評估的主要依據之一肺結核治療評估的主要依據之一18結核分枝桿菌結核分枝桿菌- -

9、實驗室檢查實驗室檢查缺點：缺點：不能區別是否為非結核分枝桿菌不能區別是否為非結核分枝桿菌 不能區別死活菌。不能區別死活菌。 結核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現假陰性。結核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現假陰性。 檢測靈敏度較低（檢測靈敏度較低（104-105 個細菌個細菌/毫升）毫升）。19結核桿菌培養結核桿菌培養細菌學檢查細菌學檢查傳統方法：傳統方法：L-JL-J固體培養基固體培養基快速培養法快速培養法: : 檢測細菌生長過程中代謝產生的檢測細菌生長過程中代謝產生的CO2CO2或消耗的或消耗的O2O2，顯微鏡直接觀，顯微鏡直接觀察、變色液體培養基察、變色液體培養

10、基等等BACTEC MGIT960BACTEC MGIT960系統系統 BACTEC460BACTEC460系統系統、BactBact/ALERT 3D/ALERT 3D、ESPESP等。等。痰培養、其他標本培養痰培養、其他標本培養20結核桿菌培養結核桿菌培養陰性培養陰性培養陽性培養陽性培養無或微弱熒光無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強熒光強熒光傳感器傳感器對氧氣高度敏感的釕復合物對氧氣高度敏感的釕復合物肉湯肉湯改良改良Middlebrook 7H9肉湯肉湯上

11、部空間上部空間已預先充填已預先充填10% CO221結核桿菌培養結核桿菌培養1 1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+ +1 1份痰標本結核分枝桿菌培養份痰標本結核分枝桿菌培養 痰涂片陰性，肺部影像學檢查符合活動性肺結核影像學表現痰涂片陰性，肺部影像學檢查符合活動性肺結核影像學表現+1+1份痰標本結核分枝桿菌培養陽性份痰標本結核分枝桿菌培養陽性用于耐多藥結核療效判定用于耐多藥結核療效判定結核菌培養臨床結核菌培養臨床價值價值確診結核確診結核22抗酸桿菌培養優缺點抗酸桿菌培養優缺點敏感性較直接涂片法高，理論上敏感性較直接涂片法高，理論上10-10010-100條菌條菌

12、/ /毫升可檢出陽性；毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產生初步判斷非特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產生初步判斷非結核分枝桿菌；結核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養物，為進一步藥敏試驗提供基礎。分離出具有活力的純培養物，為進一步藥敏試驗提供基礎。需時長需時長，根據接種量的大小，一般，根據接種量的大小，一般2-82-8周才能得到肉眼可見菌落。周才能得到肉眼可見菌落。結果受標本保存運送時間、培養基成分和質量、前處理方法等影響，結果受標本保存運送時間、培養基成分和質量、前處理方法等影響， 操作操作較直接涂片法較直接涂片法復雜復雜，需經嚴格培訓，需經嚴格培訓

13、 。需培養基凝固滅菌器、離心機、渦旋振蕩器、恒溫培養箱等需培養基凝固滅菌器、離心機、渦旋振蕩器、恒溫培養箱等設備設備。成本成本是直接涂片法的是直接涂片法的7-87-8倍。倍。23細胞免疫學檢查細胞免疫學檢查 結核菌素皮膚試驗（結核菌素皮膚試驗（PPD試驗）試驗） 干擾素釋放試驗（干擾素釋放試驗（T-SPOT試驗）試驗）24免疫學檢查免疫學檢查細胞免疫學細胞免疫學檢查檢查PPD-PPD-結核菌素試驗結核菌素試驗遲發型細胞超敏反應遲發型細胞超敏反應1 1）方法：）方法：1:2000 OT1:2000 OT或或PPDPPD液液0.10.1毫升毫升(5(5單位單位) )，左左前臂屈側中部前臂屈側中部皮

14、內注射，皮內注射，48-72h48-72h測量皮膚測量皮膚硬結硬結的直的直徑徑。25PPD-PPD-結核菌素試驗結核菌素試驗2 2）判斷標準判斷標準：陰性陰性4mm4mm弱陽性弱陽性5-9mm5-9mm陽性陽性10-19mm10-19mm，強陽性強陽性20mm20mm或局部出現水泡與壞死或局部出現水泡與壞死26PPD-PPD-結核菌素試驗結核菌素試驗3)3)結核菌素試驗的意義結核菌素試驗的意義陰性陰性：無結核菌感染；不能排除結核感染。：無結核菌感染；不能排除結核感染。陽性陽性：曾有結核感染，并不一定現在患病。：曾有結核感染，并不一定現在患病。強陽性強陽性：活動性結核病可能：活動性結核病可能 A

15、、變態反應尚未建立；、變態反應尚未建立；B、免疫抑制如應用皮質、免疫抑制如應用皮質激素或營養不良等激素或營養不良等27PPD-PPD-結核菌素試驗結核菌素試驗 PPDPPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環境分枝桿菌及卡介苗所含抗原為致病性分枝桿菌、環境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的菌株所共有，其結果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，影響，特異性較差特異性較差。 當出現免疫功能低下時可出現假陰性結果當出現免疫功能低下時可出現假陰性結果，敏感性低敏感性低。 免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結核

16、變態反應、淋巴結核強陽性多。核變態反應、淋巴結核強陽性多。 經濟、簡便，可以用于流行病學大規模的篩查和普查，但經濟、簡便，可以用于流行病學大規模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。存在著明顯的缺陷。PPDPPD試驗臨床價值試驗臨床價值28T-SPOTT-SPOT實驗實驗細胞免細胞免疫學檢查疫學檢查T-SPOTT-SPOT試驗原理試驗原理結核感染者體內存在特異的效應結核感染者體內存在特異的效應T T淋巴細胞，效應淋巴細胞，效應T T淋巴細胞再次受到淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-IFN-）。）。因此，因此，檢測效應檢測效應T T淋巴細胞可

17、用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。既用抗體捕獲培養中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色方式既用抗體捕獲培養中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色方式將其表現出來。將其表現出來。刺激抗原刺激抗原：ESAT-6ESAT-6蛋白蛋白(早期分泌抗原靶早期分泌抗原靶6） 、CFP-10CFP-10蛋白（蛋白（培養濾液蛋白）培養濾液蛋白）由結核分枝桿菌特有的由結核分枝桿菌特有的RD1RD1基因編碼基因編碼，可刺激活化的效應，可刺激活化的效應T T淋巴細胞產生淋巴細胞產生干擾素。干擾素。 RD1RD1基因在基因在BCGBCG以及大部分環境分枝桿菌中缺失。以及

18、大部分環境分枝桿菌中缺失。29T-SPOTT-SPOT試驗試驗干擾素干擾素檢測陰性檢測陰性干擾素干擾素檢測陽性檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞 干擾素30T-SPOT步驟步驟31T-SPOTT-SPOT靈敏度靈敏度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0% (12/12) Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3% (20/24) Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6% (84/87) Goletti et al

19、Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3% (21/23) Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9% (70/73) Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*92.2% (59/64) Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3% (57/58) Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0% (27/30) Detjen et al CID 2007 1;45(3):32

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23、d Microbiol Immunol. 2008. Epub ahead of print*95.9% (47/49) TOTAL92.0% (1139/1238) 靈敏度靈敏度基本基本不受免疫力低下不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結核患者中有很受抑制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率高的檢出率 美國美國FDA數據：靈敏度數據：靈敏度95.6%(175/183) 國內臨床數據：靈敏度國內臨床數據：靈敏度95.3%(624/655)32結核桿菌結核桿菌 特異性高特異性高只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數環境分枝桿菌和卡介苗（只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數環境分枝桿菌和卡介苗

24、（BCG）無交叉反應無交叉反應 美國美國FDA數據：特異性數據：特異性97.1%(297/306) 國內臨床數據：特異性國內臨床數據：特異性94.1%(478/508)33PPDPPD皮試與皮試與T-SPOTT-SPOT試驗試驗PPD皮試皮試T-SPOTT-SPOT試驗試驗估計的敏感性估計的敏感性(活動性活動性結核的患者）結核的患者）7590%（對免疫抑制患對免疫抑制患者的敏感性進降低明顯者的敏感性進降低明顯）7595%（對免疫抑制患者對免疫抑制患者的敏感性降低不明顯的敏感性降低不明顯）估計的特異性（無結核估計的特異性（無結核病史或暴露史的健康人）病史或暴露史的健康人）7095%（接種（接種B

25、CG者的者的特異性進一步降低）特異性進一步降低）90100%（接種（接種BCG者的特者的特異性不變）異性不變）與與BCG的交叉反應的交叉反應存在存在存在的可能性較小存在的可能性較小與與NTM的交叉反應的交叉反應存在存在存在的可能性較小存在的可能性較小與與M.TB暴露的相關性暴露的相關性存在存在相關性較相關性較PPD皮試大皮試大陽性結果與隨訪期間罹陽性結果與隨訪期間罹患結核的相互關系患結核的相互關系中到顯著的正相關中到顯著的正相關無充足的證據無充足的證據可重復性可重復性中等，但可變中等，但可變較高，但證據較少較高，但證據較少 PPD皮試皮試和和T-SPOTT-SPOT試驗試驗的比較的比較34T-

26、SPOTT-SPOT試驗試驗結果解釋結果解釋 陰性結果陰性結果提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：細胞。假陰性結果：感染階段不同；少數免疫系統功能不全感染階段不同；少數免疫系統功能不全/疾??；實驗非正常操作。疾病；實驗非正常操作。 陽性結果陽性結果提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染。但細胞，患者存在結核感染。但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結果：果： 4種環境分枝桿菌

27、感染時：種環境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、（蘇氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）減少了醫生主觀因素對檢測結果的影響減少了醫生主觀因素對檢測結果的影響; 故雖然檢測儀器昂貴，操作相對較為復雜，但仍可視為進行結核病早期故雖然檢測儀器昂貴，操作相對較為復雜，但仍可視為進行結核病早期診斷的較為理想的手段。診斷的較為理想的手段。35非血液樣本檢測非血液樣本檢測 T-SPOT可通過一些體液成功地診斷出活動性結核： 支氣管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部） 腦脊髓液（“CSF”）（中樞神經系統） 胸腔積液（肺

28、部周圍） 腹膜液（腹腔） 非血樣本的T-SPOT結果很強的話（即存在大量的結核效應T細胞）,揭示在這個器官或部位存在活動性結核 非血樣本中不存在結核效應T細胞，說明這個器官或部位沒有活動性結核36各國對潛伏感染風險人群的篩查指南各國對潛伏感染風險人群的篩查指南風險人群風險人群美國指南美國指南加拿大指南加拿大指南英國指南英國指南免疫力抑制人群（例如，免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用強的松感染者，使用強的松或或TNF-抑制劑治療）抑制劑治療）TST或或IGRA；如果是；如果是陰性或高度懷疑的，陰性或高度懷疑的，TST和和IGRA都要檢查都要檢查TST，如果，如果TST陰性要用陰性要用IGRA確認確認TST或或IGRABCG接種者（如果也屬于接種者（如果也屬于其它風險人群）其它風險人群）推薦用推薦用IGRA沒有特定的推薦沒有特定的推薦TST或或IGRA與傳染性肺結核患者密切與傳染性肺結核患者密切接觸接觸TST或或IGRATST，用，用IGRA進一步確進一步確認認TST