1、細菌基因組DNA的提純與純化姓名 學(xué)號 同組人 班級 實驗時間摘要：不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同。目前，有許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離到高純度的DNA。本次實驗選用黃色粘球菌DK1622，使用試劑盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)進行細菌基因組DNA的提純與純化，旨在學(xué)習(xí)并掌握細菌基因組DNA提取的原理和方法。通過本次實驗，我們達到了實驗預(yù)期，取得了良好的實驗效果。關(guān)鍵詞：黃色粘球菌DK1622、基因組DNA、試劑盒法1.引言生物的大部分或幾乎全部DNA都集中在細胞核或核質(zhì)體中。真核細胞的DNA主要存在于細胞核

2、中，與蛋白質(zhì)相結(jié)合構(gòu)成大小不一的染色體。而原核生物的DNA不與任何蛋白質(zhì)相結(jié)合。基因組DNA的提取一般包括：破碎細胞；去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子；沉淀核酸；去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)；純化干燥；溶解等幾個主要步驟。破碎細胞是為了釋放DNA，其方法因樣本不同而不同，可用反夏凍融、SDS和NaOH處理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超聲波破碎等方法。蛋白質(zhì)對DNA制品的污染常常影響到后續(xù)的DNA操作過程，因此，在DNA提取過程中必須把蛋白質(zhì)除去。一般去除蛋白質(zhì)常用酚氯仿抽提法。酚、氯仿對蛋白質(zhì)有極強的變性作用，而對DNA無影響，經(jīng)酚氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相與水相的界面，DNA則留在水

3、相。這種方法對于去除DNA中大量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)是行之有效的，因此也是DNA純化中的基本方法。少量的或與DNA緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)雜質(zhì)則可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也會有RNA雜質(zhì)，但RNA極易降解。況且，少量的RNA對DNA操作無大影響，必要時可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑，常用的方法是利用冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心將核酸回收。用70%80%乙醇洗滌沉淀，可除去沉淀中多余的鹽，以避免其對核酸溶解的影響以及對后續(xù)步驟的酶促反應(yīng)的抑制作用。在進行基因組的大量提取時，利用基因組DNA較長的特性，可以將其與細胞器的小分子DNA或質(zhì)粒DNA分離。由于

4、基因組DNA一般都很長，對剪切力十分敏感，提取時容易發(fā)生機械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段。因此，在基因組DNA提取過程中，為保證得到較長的DNA，應(yīng)盡量避免以下因素導(dǎo)致的DNA降解：（1）物理降解。在實際操作時應(yīng)盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉(zhuǎn)移和劇烈的振蕩等，以減少機械張力對DNA的損傷，同時也應(yīng)避免過高的溫度。此外，操作所用的吸頭口不能太小，應(yīng)剪去尖端部分，使其孔徑變大。（2）細胞內(nèi)源DNase的作用。細胞內(nèi)常存在活性很高的DNase，細胞破碎后，DNase便可與DNA接觸并使之降解。為了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用

5、，而Ca2+和Mg2+是DNase的輔助因子。SDS和蛋白酶則分別具有使蛋白質(zhì)變性和降解的作用。（3）化學(xué)因素也會降解DNA。例如，過酸的條件下，由于DNA存在腺嘌呤而導(dǎo)致DNA的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂。因此，在DNA提取過程中，應(yīng)避免采用過酸條件。不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同。目前，也有許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離到高純度的DNA。電泳是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中

6、，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如EB染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強度是同DNA片段的大

7、小（或數(shù)量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個因素：（1）樣品DNA分子的大小：電泳時，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的構(gòu)象：分子量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA（cccDNA）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA（ocDNA）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA（Liner DNA）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷

8、移率。一般情況下，超螺旋型（cccDNA）遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀（ocDNA）分子。（3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大，DNA電泳遷移速度越快，即分子量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越小。（4）電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比。電壓愈高帶電顆粒泳動愈快，但隨著電場強度增加，高分子量DNA的泳動速率以不同幅度增加，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減小，為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應(yīng)小于5V/cm。（5）電泳緩沖液:

9、 在進行分子電泳時所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度。常見的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。電泳緩沖液的作用：維持合適的pH。電泳時，正極發(fā)生氧化反應(yīng)（4OH-+4e-2H2O+O2），負(fù)極發(fā)生還原反應(yīng)（4H+4e-2H2），長時間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強的緩沖能力，使溶液兩極的pH保持基本不變；使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應(yīng)含有0.010.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化；電泳緩沖液還有一個組分是EDTA，加入濃度為12mM，

10、目的是螯合Mg2+等離子，防止電泳時激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。電泳緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率，當(dāng)電泳液為無離子水（如不慎在凝膠中忘記加緩沖液，即誤用蒸餾水配置凝膠），溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下（如錯用10×電泳緩沖液），導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性。（6）溫度：DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的行為受堿基組成和凝膠溫度影響不明顯。不同大小DNA片段的相對電泳遷移率在430內(nèi)無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0.5時凝膠很脆弱，最好在4下電

11、泳以增加凝膠強度。2.材料和方法2.1 材料和試劑實驗菌株：黃色粘球菌DK1622實驗試劑：試劑盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)、TE溶液、BTL buffer、proteinase K溶液、RNase A、BDL buffer、無水乙醇、buffer HB、wash buffer、Elution Buffer、瓊脂糖、滅菌雙蒸水ddH2O、1×TAE緩沖液、溴化乙錠（EB）溶液、6×上樣緩沖液（6/10×loading buffer）實驗儀器：離心機、水浴鍋、渦旋振蕩器、微量移液器、不同類型的槍頭、1.5mL Ep管2.2

12、方法2.2.1試劑盒法提取細菌基因組DNA（1）將黃色粘球菌培養(yǎng)液倒入1.5mL Ep管中，在離心機中10,000rpm離心2min，棄上清。（2）重復(fù)收集一次，即繼續(xù)向剛才的1.5mL Ep管中倒入黃色粘球菌培養(yǎng)液，重復(fù)以上步驟，使1.5mL Ep管中共收集3.0mL培養(yǎng)液中的菌體。（3）向菌體沉淀中加入500L TE，充分渦旋重懸。（4）將菌液在離心機中10,000rpm離心2min，盡可能吸棄上清。（5）向菌體沉淀中加入200L BTL buffer，渦旋重懸。（6）向菌液中加入25L proteinase K溶液，渦旋混勻；（7）將菌液55水浴45min，期間每1520min振蕩混勻一

13、次。（8）向菌液中加入5L RNase A，顛倒混勻。（9）將菌液放置在水浴鍋中37水浴30min。（10）將菌液在離心機中12,000rpm離心5min。（11）小心轉(zhuǎn)移上清到一新的Ep管中。（12）加入220L BDL buffer，顛倒混勻。（13）65水浴10min。（14）加入220L 無水乙醇，充分渦旋，確保沒有任何沉淀。（15）將DNA純化柱（藍色）組裝到2mL收集管上。（16）將上述樣品全部、小心轉(zhuǎn)移到柱子中。（17）12,000rpm離心1min，棄流出液。（18）將柱子組裝到第二個收集管上，加入500L buffer HB。（19）12,000rpm離心1min，棄流出液。

14、（20）將柱子組裝到同一個收集管上，加入700L wash buffer。（21）12,000rpm離心1min，棄流出液。（22）重復(fù)洗滌一次，即再加入700L wash buffer，12,000rpm離心1min，棄流出液。（23）使用同一收集管，13,000rpm離心2min。（24）將柱子安裝到新的Ep管上，加入50L 65預(yù)熱的Elution Buffer，室溫靜置5min。（25）12,000rpm離心1min，收集DNA。（26）重復(fù)收集一次。2.2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA（1）0.8%瓊脂糖凝膠的制備。正確組裝制膠槽、制膠板、樣品梳。取40mL 1×TAE

15、至250mL干凈紅蓋瓶中，稱量0.3g瓊脂糖，混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無顆粒。待溶液冷卻至60左右，加入20L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5g/mL，混勻后緩緩倒入架好樣品梳的制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時間要在30min以上）。之后輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1×TAE電泳緩沖液），即可上樣。（2）電泳上樣。取1.0L純化DNA、4L雙蒸水、1L上樣緩沖液（6/10×loading buffer），用微量移液器吹吸混勻。將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm

16、。將上述混合好的DNA樣品，按照表1順序，點樣到凝膠中。（3）凝膠電泳與DNA分離。開啟電泳儀電源。選擇合適的電壓（120V）和時間（40min）。將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連。啟動電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開。電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠。紫外燈下觀察電泳結(jié)果，攝片，保存，分析。表1 DNA樣品加樣順序泳道1234567樣品 DNA/Hind 1組DNA樣品2組DNA樣品3組DNA樣品4組DNA樣品5組DNA樣品樣量5L5L6L6L6L6L6L泳道891011121314樣品DL 20006組DNA樣品7組D

17、NA樣品8組DNA樣品9組DNA樣品10組DNA樣品/Hind 樣量5L6L6L6L6L6L5L3.結(jié)果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14bp9,4166,5574,3612,3222,027圖1. 試劑盒法提取細菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳（1） DNA、/Hind 、DL 2000的作用是marker。這些marker都是線形DNA。細菌基因組DNA在細菌體內(nèi)呈環(huán)形，經(jīng)實驗提取后呈線形。提取得到的細菌基因組DNA應(yīng)該越完整越好。（2）本實驗選用的瓊脂糖凝膠濃度為0.8%，DNA片段有效分離范圍大約是0.220kb，DNA片段如果大于20kb將無法分開從而導(dǎo)

18、致DNA片段堆積在一起。在此次實驗中，提取得到的細菌基因組DNA大小大于20Kb，因此DNA片段堆積。泳道5是我們組做到實驗結(jié)果，可見圖中箭頭所指位置即使我們組提取得到的細菌基因組DNA條帶。另外我們組得到的DNA條帶較淺，是因為我們組收集的黃色粘球菌菌體量較少。（3）泳道1加的樣品 DNA是原始DNA，大小為48Kb，該片段較大，在0.8%瓊脂糖凝膠中無法分辨出來。在普通電泳中無法分辨出DNA大片段。（4）泳道2加的樣品是/Hind 。Hind 是限制性核酸內(nèi)切酶，可以酶切 DNA。 DNA是線形DNA，其上含有7個Hind 酶切位點，因此Hind 將 DNA酶切成8個DNA片段。這8個DN

19、A片段大小分別是125bp、564bp、2,027bp、2,322bp、4,361bp、6,557bp、9,416bp、23,130bp。最小的DNA片段是125bp，最大的DNA是23,130bp。23,130bp的DNA片段已經(jīng)超出0.8%瓊脂糖凝膠的有效分辨范圍，所以該DNA片段會發(fā)生堆積的現(xiàn)象。在該樣品中，雖然各種DNA片段分子數(shù)一樣，但是DNA片段的摩爾質(zhì)量不同，所以導(dǎo)致DNA片段質(zhì)量不同。所以在泳道2的DNA電泳圖中兩個DNA小片段（125bp和564bp）觀察不到，而較大的DNA片段可以很明顯地觀察到。如果想觀察到小片段，可以多加樣品。另外由于DNA帶負(fù)點而EB帶正電，電泳時DN

20、A向正極移動而EB向負(fù)極移動。泳道2的樣品/Hind 中兩個DNA小片段（125bp和564bp）相對分子質(zhì)量較小，電泳遷移速率較快，EB向正極遷移導(dǎo)致電泳結(jié)束后這兩個DNA小片段所處的凝膠位置EB濃度較小，DNA染色不明顯。（5）泳道2的樣品量與泳道1的相等（均是5L），但是泳道2的DNA條帶要比泳道1的亮，是因為泳道2的DNA濃度較大。（6）某些點樣孔的邊緣（尤其是下邊緣）出現(xiàn)熒光，泳道4、泳道6、泳道7等對應(yīng)的點樣孔下邊緣可明顯觀察到此現(xiàn)象。該現(xiàn)象說明這些提取的細菌基因組DNA中含有殘留的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)在一起，而蛋白質(zhì)與DNA遷移方向相反，導(dǎo)致蛋白質(zhì)阻礙了部分DNA泳動，從而

21、在點樣孔的邊緣形成熒光。另外在這些點樣孔下邊緣的下方還有一條DNA條帶，這是由于提取的樣品中某些DNA片段太大從而遷移速度過慢產(chǎn)生的。（7）某些DNA條帶是彎曲的（“微笑”條帶），泳道2、泳道14的DNA電泳圖中處于靠上位置的“微笑”條帶很明顯，其形成原因有兩個：第一，加樣孔不是規(guī)則的長方體形（在0.8%瓊脂糖凝膠制備過程中拔梳子的時候梳子可能導(dǎo)致加樣孔損壞）；第二，上樣量多。（8）泳道8加的樣品是DL 2000，從上往下可以看到6條DNA條帶，對應(yīng)的DNA片段大小分別是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp。DL 2000中樣品中較小的DNA片段（250bp和100b

22、p）電泳遷移速率較快，電泳時EB向正極遷移導(dǎo)致電泳結(jié)束后DNA小片段所處的凝膠位置EB濃度較小，DNA染色不明顯。4.討論（1）此次實驗中細菌選用的是黃色粘球菌DK1622，其特性是：基因組全長9.13Mb，代時4小時，胞外基質(zhì)富含粘多糖。黃色粘球菌菌液呈黃色，是因為黃色粘球菌含有黃色色素。（2）黃色粘球菌菌體收集過程中也可以將黃色粘球菌培養(yǎng)液倒入2個1.5mL Ep管中，其他操作不變，同時收集個2個Ep管中的菌體，最后加入TE重懸后合并。TE溶液是pH緩沖液，含有10mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA，呈弱堿性，有利于保護堿基對，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)。同時TE溶液

23、含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。（3）加入BTL buffer后菌液變清亮而且有氣泡產(chǎn)生。BTL buffer的作用：buffer里面含有SDS，SDS的作用是裂解菌體；buffer里面含有核酸酶抑制劑，可以抑制DNA酶的活性；buffer還要調(diào)節(jié)菌液的pH值使pH值達到proteinase K最適pH值。（4）黃色粘球菌菌體的裂解實驗步驟的前兩步的目的是將不溶性細胞碎片以離心方式沉淀，如果實驗過程中發(fā)現(xiàn)沒有細胞碎片則可以不做這兩步。（5）黃色粘球菌菌體的裂解實驗步驟中“（3）加入220L BDL buffer，顛倒混勻”的目的是使蛋白質(zhì)在高鹽溶液中鹽析形成沉淀，而DNA仍溶解在溶

24、液中，但在低鹽溶液中DNA不溶而蛋白質(zhì)溶；“（4）65水浴10min”的目的是促進DNA溶解；“（8）12,000rpm離心1min”的目的是使DNA與純化柱結(jié)合；“（14）使用同一收集管，13,000rpm離心2min”的目的是去除殘留的乙醇；“（16）12,000rpm離心1min”的目的是收集DNA。（6）在上次實驗“質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測”中，質(zhì)粒DNA的相對分子質(zhì)量較小，所選用的瓊脂糖凝膠濃度是1%。而在這次實驗中，細菌基因組DNA的相對分子質(zhì)量較大。而DNA相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。因此本實驗所選用的瓊脂糖凝膠濃度應(yīng)該減小，所以實驗中選用的瓊脂糖凝膠濃度為0

25、.8%。瓊脂糖凝膠濃度沒有選得更小是因為當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度小于0.6%時會使膠很脆，不容易從制膠板中拿出來，增加實驗操作的困難性。（7）核酸分離純化的總原則：第一，保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；第二，排除其他分子的污染。（8）在使用離心機時，樣品放置要對稱平衡，否則會嚴(yán)重?fù)p害離心機的使用壽命。（9）應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，否則溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。對于瓊脂糖溶液來說，如果膠液溫度過高，會使制膠板、制膠槽、樣品梳變性，從而影響膠孔大小和膠形狀，間接影響加樣量和跑條帶。如果膠液溫度過低，瓊脂糖凝膠會凝固，所以在膠液冷卻至60左右倒膠。膠液冷卻至60左右后需要加EB，EB是一種強烈的誘變劑，應(yīng)戴手套進行操作。制膠的時候要除去氣泡。（10）凝膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄壞點樣。拔梳子的時候要特別小心，以防凝膠與支持物脫離