1、白芷擴增片段長度多態(tài)性反應體系的建立及優(yōu)化 作者：陳要臻 郭丁丁 馬逾英， 陳雯，王曉東，唐琳 【摘要】 目的建立白芷擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）反應體系及篩選出擴增條帶豐富的引物。方法以12 份白芷為試材,對AFLP 分析過程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取質(zhì)量和濃度、Mse/ EcoR酶切反應時間等進行了研究 作者：陳要臻 郭丁丁 馬逾英， 陳雯，王曉東，唐琳【摘要】 目的建立白芷擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）反應體系及篩選出擴增條帶豐富的引物。方法以12 份白芷為試材,對AFLP 分析過程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取質(zhì)量和濃度、Mse/ EcoR酶切反應時間等進行了研究

2、，從64對引物中篩選適合白芷的引物。結(jié)果改良的CTAB方法提取的DNA質(zhì)量比較好，建立了一種適于白芷AFLP 銀染技術(shù)的優(yōu)化體系：模板DNA 的用量為400 ng ,酶切體系中Mse和EcoR反應時間為4 h，篩選出了7對適合白芷的引物。以引物E+AGC/M+CAA構(gòu)建的白芷種質(zhì)資源的AFLP 指紋圖譜,擴增帶多,多態(tài)性強。結(jié)論建立了適用于白芷的AFLP反應體系，并篩選出了適合白芷的引物，為今后利用AFLP標記技術(shù)進行白芷鑒定及種質(zhì)遺傳多樣性分析提供了標準化程序。 【關(guān)鍵詞】 擴增片段長度多態(tài)性反應體系; 白芷Abstract：ObjectiveTo establish an optimize

3、d AFLP(amplified fragment length polymorphism) analysis system of Angelica dahuruica.MethodsThe optimized AFLP analysis system was established with 12 Angelica dahuruica from different habitats after a comparative study of the essential factors which influenced the results of AFLP method. ResultsThe

4、 improved CTAB conventional method was better to AFLP than SDS method. The results of the analysis system showed that 1)the dosage of template DNA was 400ng; 2) the time of digest system was 4h; 3) the products of preamplification should be diluted to 10 times; 4)seven pairs of primer(E+AGC/M+CAA,E+

5、ACT/M+CAC,E+AGC/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC)were selected from 64 pairs by screening repeatedly. And E+AGC/ M+CAA could amplify more uniform and high sharp bands. ConclusionOur study showed that the AFLP was suitable for genetic diversification,variety identification,constr

6、uction of molecular map , identification and classification. These results provide fundamentals for further molecular studies of Angelica dahuruica using AFLP marker.Key words：AFLP system; Angelica dahuruica 擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）技術(shù)作為一項分子標記技術(shù)，是1992年由荷蘭Keygene公司科學家Zab

7、eau Mare和Vos pieter 發(fā)明并發(fā)展起來的一種選擇擴增限制性酶切片段的方法1。AFLP是基于RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) 和PCR(Polymerase Chain Reaction) 相結(jié)合的DNA 分析技術(shù)。這種方法是一種選擇性擴增限制性片段的方法,它結(jié)合了RFLP 和RAPD 的優(yōu)點,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。現(xiàn)已被廣泛應用于生物多樣性、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆等諸多領(lǐng)域2。 白芷Angelica dahurica為傘形科植物，是一種常用中藥，性溫，味辛，具有散風除濕、通竅止痛、消

8、腫排膿的功效。目前對白芷的研究主要集中在白芷的品質(zhì)、化學成分、藥理作用等方面，其種質(zhì)資源多樣性、親緣關(guān)系等方面的研究也有一些報道3，4，但是運用AFLP技術(shù)對白芷基因組的研究還未見報道。因此本研究旨在建立一套適合于白芷的AFLP實驗體系，并篩選出多態(tài)性強的引物，為進一步研究白芷的遺傳多樣性、種間親緣關(guān)系A(chǔ)FLP實驗奠定基礎(chǔ)。1 材料與儀器1.1 材料白芷，2007-04采自四川遂寧GAP基地白芷種質(zhì)資源圃。材料原產(chǎn)地見表1。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學生藥教研室馬逾英教授鑒定。取新鮮葉片，用硅膠迅速干燥后帶回實驗室，儲于-70冰箱保存。表1 供試材料及來源（略）1.2 試劑EcoR，Mse，T4 DN

9、A ligase，rTaq酶，dNTPs購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。Mse IEcoR I接頭、Mse IEcoR I核心引物及Mse IEcoR I選擇性擴增引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。親和硅烷、剝離硅烷等購于北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。甲叉雙丙烯酰胺為瑞士進口分裝。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 儀器Bio-Rad(MC013208)PCR擴增儀，Gene Genius Bio-imaging System凝膠成像儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-20C型垂直電泳系統(tǒng)。2 方法2.1 基因組DNA的提取與DNA質(zhì)量檢測采用CTAB 和SDS 法5,6 ，并進行改

10、良。取3 l總DNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene Genius Bio-imaging System凝膠成像分析系統(tǒng)檢測DNA 質(zhì)量。然后用UV-VIS Spectrophotometer(Tu-1901) 型紫外分光光度儀分別測定其在260 nm，280 nm處的OD值。純的DNA溶液OD260/OD280應為1.8。OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染，小于1.6時表明有蛋白質(zhì)或酚污染7 。合格的DNA濃度等于：OD260樣品稀釋倍數(shù)50/1 000。最后統(tǒng)一調(diào)整DNA濃度為100 ngl-1。2.2 白芷AFLP體系的建立AFLP實驗流程按鄒喻蘋8 等的方法進行，

11、并參考他人在其它作物上的反應程序9，10，15 進行優(yōu)化。2.2.1 基因組DNA的限制性酶切本實驗選用EcoR、Mse酶切組合來研究白芷的DNA 多態(tài)性水平。于1 500 l的離心管中加入下列物質(zhì)：10NEB2 bufer2 5 l，樣品DNA模板設計5個等次即100，200，300，400，500 ng，Mse(10 Ul-1) 1.0 l，EcoR (20 Ul-1) 0.6 l，10 NEB buffer2 5 l，100BSA 0.5 l，雙蒸水補足體積到50 l。為了獲得白芷基因組DNA雙酶切的最佳時間，將反應液混勻后置于37分別酶切2，4，6 h后，用1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切

12、完后65溫浴10 min鈍化限制性內(nèi)切酶。取出后置于4冰箱備用。2.2.2 接頭連接取40 l經(jīng)過酶切的DNA樣品，加入EcoR 接頭（30 pml-1）0.3 l，Mse 接頭（33 pml-1） 2.0 l，T4DNA ligase(400 Ul-1) 1.2 l， T4 ligase buffer 5.0 l，ddH2O 1.5 l，總體積為50 l。16連接過夜。一部分稀釋10倍作為預擴增模板。稀釋好的產(chǎn)物和剩余產(chǎn)物置于-20貯存。2.2.3 預擴增反應取連接完成的DNA 5 l，加入EcoR 預擴增引物（50 pml-1）2.0 l，Mse 預擴增引物（50 pml-1）2.0 l，

13、10PCR buffer(Mg2+ free) 5.0 l，MgCl2（25 mmolL-1）4.0 l，dNTP（2.5 mmolL-1）4.0 l，rTaq酶（5 Ul-1) 0.5 l，雙蒸水補足體積到50 l。反應液在離心機上低速短暫混勻。擴增程序如下：94 2 min，94 30 s，56 30 s，72 1 min，共30個循環(huán)；72 5 min；4 +；反應結(jié)束后取5 l PCR產(chǎn)物用1的瓊脂糖凝膠電泳檢測預擴增效果，然后將預擴增產(chǎn)物稀釋1020倍置于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4 選擇性擴增選擇性擴增反應體系為25 l。分別取稀釋5，10，15，20倍的預擴增產(chǎn)物各3 l，Ec

14、oR選擇性引物（50pml-1）1.0 l，Mse選擇性引物（50 pml-1）1.0 l， 10PCR buffer(Mg2+ free) 2.5 l，MgCl2（25mmolL-1）2.0 l， dNTPs（2.5 mmoll-1）2.0l，rTaq酶（5Ul-1) 0.2 l，ddH2O 13.3 l。PCR反應條件：94 2 min，94 30 s，65 30 s，72 1 min ，接下來的12個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.7；94 30 s，55.5 30 s，72 1 min 進行23循環(huán)；72 5 min；4 +；反應結(jié)束后取5l用1的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，將選擇性擴增產(chǎn)物置于

15、-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染參照本實驗室已成熟的方法9，并稍做修改。取5 l選擇性擴增產(chǎn)物加入3 l loading buffer混合，95變性5 min，立即冰浴，Maker也做同樣處理。加樣前70W恒功率預電泳45 min，使膠板溫度達到40以上，然后上樣，75W恒功率電泳70 min。固定：電泳結(jié)束后，取下膠板，小心分開，把帶膠的玻璃板放入10%的2L冰醋酸中固定，放在搖床上低速搖動，30min。用蒸餾水漂洗兩次，3 min/次。染色：膠板放入新配置的染色液(2L,2 g AgNO3,3 ml 37%HCHO，2L H2O）中染色30

16、min。然后用去離子水漂洗10s。顯影：膠板轉(zhuǎn)入預冷的顯影液(2L,60 g無水碳酸鈉，3ml 37%HCHO，400 l 10mg/ml硫代硫酸鈉，2L H2O），輕搖至條帶清晰（68 min）。終止：用10%的冰醋酸2L定影。最后用蒸餾水漂洗5 min，室溫自然風干。2.2.6 選擇性引物篩選AFLP的引物從64 ( 8 8 ) 對AFLP 核心引物組(見表2)依次測試，比較指紋圖譜的清晰度與多態(tài)性。表2 AFLP 選擇性擴增引物序列（略）3 結(jié)果3.1 模板DNA 的提取對AFLP 而言，模板DNA 的制備是非常重要的一個環(huán)節(jié)。模板DNA 質(zhì)量直接關(guān)系著實驗的成敗，因為模板的質(zhì)量將影響酶切是否充分及以后的連接反應。在實驗中提取白芷DNA 采用了CTAB 和SDS 兩種方法，基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠上30min 左右，其結(jié)果如圖1顯示。SDS 法提取的DNA點樣孔十分明亮，說明含有較多的雜質(zhì)，而CTAB 所提DNA無降解，無RNA污染，樣品均勻，條帶清晰，分子量在2000bp左右，且點樣孔周圍沒有雜質(zhì)。而且經(jīng)過測定，CTAB提取的白芷DNA 的OD260/OD280值在1.8左右，SDS法提取的白芷DNA 的OD260/OD280值在1.