1、糖預(yù)處理對(duì)外周組織應(yīng)激性胰島素抵抗的影響及機(jī)制探討 科技計(jì)劃項(xiàng)目可行性研究報(bào)告 （1）立項(xiàng)的背景和意義。現(xiàn)代創(chuàng)傷以致傷原因多樣、傷情復(fù)雜、診療難度大而嚴(yán)重威脅人民群眾生命和財(cái)產(chǎn)安 全。近年來(lái)， 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展， 以交通傷為主的各種類型創(chuàng)傷發(fā)生率也逐漸呈 上升趨勢(shì)。 因此， 有關(guān)創(chuàng)傷診療方面的基礎(chǔ)和臨床研究成為我國(guó)衛(wèi)生與健康可持續(xù)發(fā)展行動(dòng) 計(jì)劃的重要內(nèi)容。 加強(qiáng)對(duì)創(chuàng)傷尤其是嚴(yán)重創(chuàng)傷的深入研究對(duì)于提高療效、 改善預(yù)后、 降低傷 殘具有十分重大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。 本研究從創(chuàng)傷后一種常見而機(jī)理不清的現(xiàn)象應(yīng)激 性胰島素抵抗（ insulin resistance ，IR ）入手，通過(guò)建立

2、動(dòng)物模型，用分子生物學(xué)技術(shù)在基因 轉(zhuǎn)錄表達(dá)層面探究其內(nèi)在機(jī)制及影響因素， 為將來(lái)完全闡明胰島素抵抗機(jī)理以獲得臨床創(chuàng)傷 病人更佳的診治效果積累線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。（2）國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)。作為諸多創(chuàng)傷機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一，應(yīng)激性胰島素抵抗（insulin resistance ，IR）被認(rèn)為是一種創(chuàng)傷后常見而機(jī)理復(fù)雜的現(xiàn)象， 對(duì)其內(nèi)在發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入理解將有助于改進(jìn)臨床 創(chuàng)傷救治的策略。胰島素抵抗 （Insulin Resistance, IR ）是指機(jī)體（胰島素敏感組織） 對(duì)胰島素敏感性 （ Insulin Sensitivity ， IS）下降，或欲達(dá)到正常的效應(yīng)，需要超生理劑量的胰島素的

3、現(xiàn)象。作為多種 疾病病理生理過(guò)程的共同基礎(chǔ)，該現(xiàn)象最常見于2型糖尿病（ Diabetes Mellitus, DM ）、內(nèi)臟型肥胖、高血壓等代謝相關(guān)疾病。 1 但近年來(lái)隨著認(rèn)識(shí)的不斷深化，手術(shù) / 創(chuàng)傷后的胰島素 抵抗現(xiàn)象也越來(lái)越受到重視。應(yīng)激性（術(shù)后） IR 作為一種特殊的胰島素敏感性下降現(xiàn)象，是指創(chuàng)傷/ 手術(shù)前沒有相關(guān)代謝疾病背景，機(jī)體胰島素敏感性正常的病人，由于創(chuàng)傷/手術(shù)應(yīng)激，產(chǎn)生一系列神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的變化，引起機(jī)體對(duì)胰島素敏感性暫時(shí)性下降，出現(xiàn)類似 2 型糖尿病的 IR 現(xiàn)象，稱為應(yīng)激性 （術(shù)后）IR 2。應(yīng)激性（術(shù)后） IR 在一定程度上是機(jī)體對(duì)外界不良刺激的一 種適應(yīng)性反應(yīng)

4、， 其意義在于減少外周 （胰島素敏感組織） 對(duì)糖的利用， 維持一定的血糖水平 及滲透壓， 滿足應(yīng)激時(shí)機(jī)體的高能耗狀態(tài)， 也有利于腦等重要生命器官通過(guò)糖的凈效應(yīng) （非 胰島素依賴）獲得充足的能量，使機(jī)體度過(guò)應(yīng)激期。1 但 IR 嚴(yán)重時(shí)，往往產(chǎn)生各種負(fù)面影響，如蛋白質(zhì)、脂肪大量分解，酮體生成及糖異生作用加強(qiáng)，可導(dǎo)致負(fù)氮平衡、酸中毒、持 續(xù)性高血糖和高胰島素血癥，影響器官功能， 降低機(jī)體免疫力和修復(fù)力，等等，從而給臨床 管理及病人的恢復(fù)帶來(lái)嚴(yán)重影響。 1有鑒于此，對(duì)應(yīng)激性 /術(shù)后 IR 的防治已日益成為優(yōu)化臨 床治療策略，降低并發(fā)癥，促進(jìn)恢復(fù)，縮短住院時(shí)間和減少治療費(fèi)用的關(guān)鍵。遺憾的是，目 前對(duì)應(yīng)激

5、性 IR 產(chǎn)生的機(jī)理和作用位點(diǎn)缺乏深入全面的了解，這在一定程度上給臨床上針對(duì) 應(yīng)激性 IR 的防治工作的進(jìn)一步開展和深化帶來(lái)了困難。機(jī)理方面， 目前多數(shù)研究支持術(shù)后 IR 產(chǎn)生的部位主要在外周組織 （骨骼肌和皮下脂肪） 。 與多種代謝性疾病所致 IR 相似，受體后缺陷即胰島素與受體結(jié)合后的一系列過(guò)程異常，包 括激素受體復(fù)合物與糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)偶聯(lián)失常， 糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性下降， 糖代謝通路細(xì)胞酶缺陷等 可能為手術(shù)應(yīng)激所致 IR 的關(guān)鍵所在。 3其中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4（ Glucose Transporter-4 ， GLUT4 ）介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)因被證實(shí)是外周組織（尤其是骨骼肌）利用葡萄糖的限速

6、步驟而備受矚目。已有研究提示術(shù)后早期的 IR 與外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）葡萄糖轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白 4（Glucose Transporter-4， GLUT4 ）的轉(zhuǎn)位功能障礙關(guān)系密切 4 。但 GLUT4 介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系的效能顯然不僅僅限于轉(zhuǎn)位環(huán)節(jié)。研究表明， GLUT4 介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 系功能障礙涉及一系列潛在缺陷，包括由胰島素受體起源的信號(hào)改變； GLUT4 基因表達(dá) （mRNA 和蛋白水平）改變； GLUT4 轉(zhuǎn)位受阻（包括富含 GLUT4 的囊泡活化與募集障礙、 與胞膜融合受阻等） ；隱蔽的 GLUT4 不能有效暴露于胞外環(huán)境以及囊泡雖融合但 GLUT4 活 性下降等。 這些缺

7、陷中的一個(gè)或幾個(gè)發(fā)生時(shí)， 均可能導(dǎo)致胰島素刺激下的胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能 力下降。 5 目前，上述缺陷的一種或一些均已被發(fā)現(xiàn)存在于人體和各種動(dòng)物的肥胖癥和 2 型 DM 之中。但對(duì)于術(shù)后應(yīng)激性 IR 來(lái)說(shuō)，這些研究均僅僅處于起步階段。比如：動(dòng)物外傷 IR 模型排除了骨骼肌糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系的異常位點(diǎn)出現(xiàn)在胰島素受體和磷脂酰肌醇 3 激酶 （Phospha Tidyl Inositol 3 Kinase，PI3K）水平。提示術(shù)后 IR的位點(diǎn)在 PI3K 下游。但 新近發(fā)現(xiàn)的非 PI 3K 途徑的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和非胰島素依賴性高糖刺激的GLUT4 轉(zhuǎn)位途徑，反映了在 GLUT4 轉(zhuǎn)位發(fā)生之前的細(xì)胞內(nèi)事件的復(fù)

8、雜性。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為 IR 的發(fā)生提供了更多的潛在位點(diǎn)， 從而使術(shù)后 IR 機(jī)理的研究更趨于復(fù)雜。 6 至于有關(guān)應(yīng)激所 致 IR 與 GLUT4 基因表達(dá)的關(guān)系，所知更是甚少。目前為止， 能夠在實(shí)踐中或理論上降低術(shù)后胰島素抵抗程度的方法有： 糖預(yù)處理 （包括 口服和靜脈） , 術(shù)中使用糖和 / 或胰島素（極化液， GIK ），腫瘤壞死因子 （Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF ） 拮抗劑，蛋白激酶 C（ PKC ）抑制劑，鈣通道阻滯劑，氧自由基等。 7,8.9但由于缺乏對(duì)術(shù)后 IR 抵抗機(jī)理的深入了解，各種策略的有效性、可行性乃至應(yīng)用范圍 均尚需進(jìn)一步完善和評(píng)

9、估。其中， 口服糖預(yù)處理策略是目前相對(duì)最為簡(jiǎn)捷有效的方案7。隨著認(rèn)識(shí)的深入和觀念的改變， 其臨床價(jià)值逐漸得到認(rèn)可和接受， 在外科某些領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。 比如在全 髖關(guān)節(jié)置換術(shù)病人中已經(jīng)證實(shí)可以有效減輕術(shù)后（術(shù)后即刻和術(shù)后24 小時(shí)）胰島素敏感性的降低。 10但不足之處也較明顯。 如研究?jī)H局限于擇期手術(shù)病人， 糖預(yù)處理的確切作用位點(diǎn)及分子 機(jī)制也一直未能明確。 有研究認(rèn)為服糖主要影響術(shù)后葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝， 而對(duì)糖的非 氧化利用影響不大。但機(jī)體糖的非氧化利用本身卻要比糖的氧化利用更易受手術(shù)應(yīng)激的影 響。同時(shí)， 動(dòng)物肌樣本的體外研究中并未發(fā)現(xiàn)糖預(yù)處理有影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)的效果， 不過(guò)不排除服

10、糖確實(shí)有促進(jìn)糖氧化的作用。 11,12 這些現(xiàn)象使糖預(yù)處理減輕 IR 的機(jī)制更加撲簌迷離。 另外， 以上研究均限于 GLUT4 的轉(zhuǎn)位和糖代謝通路細(xì)胞酶學(xué)方面，而對(duì)于同樣影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)效能的 GLUT4 蛋白的基因表達(dá)問(wèn)題，當(dāng)前甚少涉及。而且，目前此類研究均局限于手術(shù)應(yīng)激導(dǎo)致的IR，鑒于創(chuàng)傷與手術(shù)應(yīng)激的區(qū)別，對(duì)于創(chuàng)傷應(yīng)激所致 IR ，均有必要在上述各個(gè)方面進(jìn)一步細(xì)化研究。因此，有必要在以下幾個(gè)方面做進(jìn)一步工作：進(jìn)一步了解創(chuàng)傷應(yīng)激發(fā)生后機(jī)體 IR 的發(fā) 生發(fā)展過(guò)程；明確外周組織（骨骼肌和皮下脂肪組織） GLUT4 基因表達(dá)層面在發(fā)生創(chuàng)傷應(yīng) 激后的變化情況； 同時(shí)在動(dòng)物創(chuàng)傷模型上增加口服糖預(yù)處理干預(yù)因

11、素， 觀察上述指標(biāo)的影響 情況。通過(guò)這些手段，探討應(yīng)激性 IR 的可能發(fā)生機(jī)制及影響因素，以及影響因素可能的作 用位點(diǎn)，將有助于加深對(duì)創(chuàng)傷病人發(fā)生 IR 現(xiàn)象的理解，為將來(lái)優(yōu)化臨床創(chuàng)傷病人的救治策 略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1. 李秀鈞主編 . 胰島素抵抗綜合征 . 第一版 . 北京: 人民衛(wèi)生出版社 , 2001. 22-252. ,128（5）:757-60.3. Nygren J, Thorell A, Karpe F, et al. The site of insulin resistance after surgery, the contribution of bed rest an

12、d hypocalori nutrition. Clin Sci,1997,93:137-147.4. Cline GW, Petersen KF, Krssak M, et al. Impaired glucose transport as a cause of decreased insulin-stimulated muscle glycogen synthesis in type 2 diabetes. N Engl J Med, 1999,341:240-246.5. Callum LE, Anna FDK, Lan WCL, et al. Insulin resistance, h

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15、 .J 國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué) ,2001,28（6）:341-310 Soop M, Nygren J, Myrenfors P, et al. Preoperative oral carbohydrate treatment attenuates immediate postoperative insulin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab,2001,280:576-583.11 Lisa Strommer, Bengt Isaksson, Malin Wickbom, et al. Effect of Carbohydrate Feeding

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17、立改進(jìn)型 Feeney 自由落體創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型， 并分組設(shè)立顱腦創(chuàng)傷組、 糖預(yù) 處理組和對(duì)照組；2以葡萄糖氧化法測(cè)定外周血血糖，以放免法測(cè)定血清胰島素，以IAI 公式法計(jì)算胰島素敏感性變化。通過(guò) RT-PCR 法測(cè)定大鼠外周組織（骨骼肌和皮下脂肪） GLUT4 信使核糖核酸（ messenger-ribonucleic acid, mRNA ）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及變化情況。技術(shù)關(guān)鍵：1復(fù)制改進(jìn)型 Feeney 自由落體創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型；2 RT-PCR檢測(cè) GLUT4 mRNA 的表達(dá)；4）預(yù)期目標(biāo)（主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)、知識(shí)產(chǎn)權(quán)申請(qǐng)情況、應(yīng)用前景）。1了解創(chuàng)傷應(yīng)激發(fā)生后大鼠胰島素敏感性的變化情

18、況暨應(yīng)激性IR 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。2明確在創(chuàng)傷應(yīng)激發(fā)生后大鼠外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）GLUT4 mRNA 表達(dá)水平的變化趨勢(shì)以及在加入糖預(yù)處理因素后的影響情況3在此基礎(chǔ)上分析創(chuàng)傷后 IR 的發(fā)生與外周組織 GLUT4 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)層面的關(guān)系并探 討應(yīng)激性 IR 的可能發(fā)生機(jī)制及影響因素， 以及影響因素可能的作用位點(diǎn)， 為將來(lái)優(yōu) 化臨床創(chuàng)傷病人的救治策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4研究結(jié)果在重要雜志上發(fā)表論文1-2 篇。5）研究方案、技術(shù)路線、組織方式與課題分解。1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 健康成年雄性同窩別同級(jí)別體重 Wistar 大鼠 36 只, 隨機(jī)分為對(duì)照組、 重型創(chuàng)傷性腦 損傷組和糖預(yù)處理組

19、, 每組各 12 只。各組均在實(shí)驗(yàn)前禁食水 12 小時(shí)，采用自制改進(jìn) 型 Feeney 自由落體創(chuàng)傷性腦損傷裝置，用 40g 砝碼從 25cm 高處墜落致重型腦創(chuàng)傷， 對(duì)照組不致傷。糖預(yù)處理組在致傷前 3 小時(shí)通過(guò)胃管灌入糖負(fù)荷 10%GS30ml ，其余 處理同損傷組。2. 血糖和血清胰島素測(cè)定分別在傷前 1/2h、傷后 3h，24h， 72h和 7day測(cè)定各組血糖和血清胰島素。每次取 鼠尾血 1 滴 OneTouch 微型血糖儀測(cè)血糖，另取血 1.0ml 用于血清胰島素測(cè)定。 將結(jié) 果進(jìn)行公式法評(píng)定 IR 的程度 6：胰島素敏感指數(shù) IAI ln（ FPG FINS）（FPG： 血糖濃度

20、； FINS ：胰島素濃度）計(jì)算各時(shí)點(diǎn)的胰島素敏感性。3. 骨骼肌和皮下脂肪組織樣本制備 兩組均于上述相應(yīng)采血時(shí)刻取大鼠股四頭肌部位骨骼肌和皮下脂肪樣本約 0.1 0.2g，立刻放入液氮中冷凍， 30min 后置于 80凍存。待 RTPCR 檢測(cè)樣本 GLUT4mRNA 含量。4. RT-PCR法檢測(cè) GLUT4 mRNA 的表達(dá)應(yīng)用 Trizol 試劑盒進(jìn)行樣本總 RNA 的提取 , 所有操作過(guò)程均預(yù)先進(jìn)行去 RNase 處理；取 2g總 RNA 作為模板 , - 80保存產(chǎn)物用高溫啟動(dòng)法進(jìn)行PCR 循環(huán) , 所有物品高壓滅菌。根據(jù)文獻(xiàn)，GLUT4 引物序列為 : GLUT4 的上游引物 5

21、-ccc cct cag cag cga gtg a-3下游引物5-gca ccg cca gga cat tgt tg- 3 ,內(nèi) 參-actin 的上游引物5-tca tga agt gtg acg tgg ac- 3下 游引物 5-acc gac tgc tgt cac ctt ca- 3引物，擴(kuò)增產(chǎn) 物用 1.5%的瓊脂糖電泳 , 溴乙錠染色檢測(cè) , GIS -1000 凝膠圖象分析系統(tǒng)分析。技術(shù)路線：6）計(jì)劃進(jìn)度安排。2012-06-30 至 2012-08-31購(gòu)買實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，預(yù)實(shí)驗(yàn)2012-09-01 至 2013-06-30建立動(dòng)物模型，實(shí)施采集血樣和標(biāo)本，處理標(biāo)本并批量檢測(cè)2013-07-01 至 2013-12