1、補陽還五湯中總黃酮的提取工藝研究    【摘要】目的：通過正交設(shè)計用不同的因素及不同的水平的提取方法來得到提取補陽還五湯中總黃酮的最佳工藝。方法：用正交試驗的方法從乙醇的濃度，提取時間，溶劑倍量，提取次數(shù)四個不同因素，每個因素設(shè)置3個不同的水平。以總黃酮含量為考察指標(biāo)，從中尋找一個最合適的提取條件。用紫外分光光度法測定總黃酮含量和純度，從而確定總黃酮提取的最佳工藝。結(jié)果：確定補陽還五湯中總黃酮的最佳工藝條件為用70的乙醇150ml煎煮3次，每次90min。結(jié)論：此次試驗以乙醇作為提取溶劑，廉價、安全，且符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 【關(guān)鍵詞】補陽還五湯；總黃酮

2、；含量測定 補陽還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的經(jīng)典復(fù)方，該方由黃芪120g、當(dāng)歸尾6g、赤芍5g、地龍、川芎、桃仁、紅花各3g組成，具有補氣、活血、通絡(luò)的功效，主治中風(fēng)及其后遺癥，其中所含的黃芪是重要的補氣中藥。本試驗研究的是補陽還五湯的提取液。它含有多糖、黃酮類和皂苷類等多種有效成分1。本試驗是恒溫水浴提取補陽還五湯中總黃酮的工藝研究，為補陽還五湯的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供資料和依據(jù)，為補陽還五湯及其它經(jīng)典復(fù)方的創(chuàng)新研究提供一定的參考價值。運用現(xiàn)代化學(xué)方法研究傳統(tǒng)中藥，建立起中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，研制出“安全、有效、可控、穩(wěn)定”的新藥。 1實驗材料 1.1器材 電子天平AG135型，恒溫水浴鍋，旋轉(zhuǎn)蒸

3、發(fā)儀，循環(huán)水式真空泵SHZ-D（）型，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9140A型，雙光束紫外可見分光光度計TU-1900型，抽濾瓶等。 1.2藥品與試劑 黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花由杭州方回春堂藥店提供。蘆丁對照品，由浙江省食品藥品檢驗所提供。無水乙醇：99.7%分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)。10%NaNO2溶液，10%Al(NO3)3溶液，1mol/l的NaOH溶液，濃氨水，1%三氯化鋁。 2實驗方法 2.1補陽還五湯總黃酮的提取2 精密稱取補陽還五湯藥材,加70%乙醇150ml,提取2次,乙醇水浴回流提取90 min,過濾,搖勻，濃縮，揮干至漿狀，剩余物用60%乙醇溶解置

4、于50ml容量瓶中,加60%乙醇稀釋至刻度,搖勻，作供試品備用。 2.2黃酮含量測定 2.2.1定性測定實驗步驟3 2.2.1.1紫外光下呈色反應(yīng):取該樣品溶液點在濾紙上,在可見光下呈灰黃色,在紫外光下呈灰褐色并有熒光斑點。 2.2.1.2濃氨水反應(yīng):取該樣品溶液點在濾紙上,將濾紙在氨水上方熏15min ,立即在紫外光下觀察( 254nm),呈極明顯的黃褐色熒光斑點。 2.2.1.3三氯化鋁反應(yīng):取樣品溶液點在濾紙上,滴加1 %三氯化鋁乙醇溶液,吹干。在可見光下呈灰黃色,在紫外光下呈黃色熒光斑點。 2.2.2定量測定4 2.2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取在105干燥恒重的蘆丁對照品20m

5、g于100ml容量瓶中,60%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,再精密量取10ml置50ml容量瓶中,60%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即得每1ml含無水蘆丁0.040mg（40ug/ml） 2.2.2.2最大吸收波長的確定5 取供試品溶液1ml放入100ml容量瓶中,加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,搖勻,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀釋至刻度,用紫外可見分光光度計將供試品溶液在400600nm 處進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照品溶液及供試品溶液在510nm 附近有最大吸收峰,實驗中選擇測定波長為510nm。 2.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線的繪制 精密量取對照品溶液2,3,4,5,6,7ml，分別置25ml容量瓶中加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,搖勻,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀釋至刻度,搖勻,制成含蘆丁3.211.2g/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。(以25ml容量瓶中加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,搖勻,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀釋至刻度,搖勻作為空白),在510 nm 波長處測定其吸光度。 結(jié)果表明，蘆丁在3.211.2g/ml范圍內(nèi)符合Beer定律,吸光度與濃度呈良

7、好的線性關(guān)系,其回歸方程為:Y=0.0239X-0.01，相關(guān)系數(shù)R=0.9991。 2.2.2.4精密度試驗 從對照品溶液中,量取2ml放入25ml容量瓶中,加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,搖勻,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀釋至刻度,搖勻。溶液1ml,搖勻,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀釋至刻度,搖勻作為空白)測在 510nm 波長處測定其吸光度,重復(fù)六次。結(jié)果見表 精密試驗結(jié)果: 結(jié)果表明，RSD%2.2.2.5穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液,依法顯色,每隔1h測定其吸收度一次,結(jié)果

8、見表,結(jié)果表明,自加完顯色劑開始其吸光度在5h內(nèi)幾乎無變化。 穩(wěn)定性實驗結(jié)果： 2.2.2.6重現(xiàn)性試驗 取同一批樣品,依法測定其含量,重復(fù)進(jìn)行6次,結(jié)果見表,結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。 重現(xiàn)性試驗結(jié)果： 2.2.2.7加樣回收率實驗 取5份已知含量的樣品,分別加入0.040mg/ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00ml,1.00ml,2.00ml,3.00ml,4.00ml,依法操作，測吸光度,計算回收率,結(jié)果見表。 加樣回收率實驗結(jié)果： 2.3總黃酮的提取工藝研究6 本試驗研究恒溫水浴提取補陽還五湯中總黃酮的含量，得出恒溫水浴提取補陽還五湯中總黃酮最適宜的條件。用正交試驗的方法從乙醇的濃度，提取時間，溶

9、劑倍量，提取次數(shù)四個不同因素，每個因素設(shè)置3個不同的水平。以總黃酮含量為考察指標(biāo)，從中尋找一個最合適的提取條件。用紫外分光光度法測定總黃酮含量和純度，從而確定總黃酮提取的最佳工藝。 2.3.1單因素考察及選用因素及水平 2.3.1.1不同乙醇濃度對提取效果的影響： 分別以30%, 50%,70%, 90%乙醇溶液150ml對補陽還五湯提取兩次, 60min /次,再測定各水平總黃酮的吸光度為0.114，0.124，0.132，0.155，得乙醇濃度為70最好。 2.3.1.2不同體積的乙醇對提取效果的影響： 分別用130，150，170，190ml，乙醇濃度為70,60 min /次,提取兩次

10、, 再測定各水平總黃酮的吸光度為0.113，0.130，0.139，0.126，得乙醇體積為170ml最好。 2.3.1.3不同時間對提取效果的影響： 溶劑量為150ml,乙醇濃度為70,提取兩次,分別用30, 60, 90, 120 min, 再測定各水平總黃酮的吸光度為0.126，0.128，0.131，0.119,得提取時間為90min最好。 2.3.1.4不同提取次數(shù)對提取效果的影響：          乙醇濃度為70,60min /次,溶劑量為150ml來提取,提取次數(shù)分別為1 次, 2 次, 3次, 4

11、 次。再測定各水平總黃酮的吸光度為0.123，0.145，0.150，0.143，得提取3次最好。 2.3.2驗證性實驗 取補陽還伍湯藥材按最佳工藝條件進(jìn)行提取，進(jìn)行驗證實驗結(jié)果見表。 3討論 試驗結(jié)果亦表明總黃酮的提取工藝與乙醇濃度及溶劑倍量有顯著關(guān)系，所以最終確定補陽還五湯中總黃酮的提取工藝條件為A2B1C3D2，確定補陽還五湯中總黃酮的最佳工藝條件為用70的乙醇150ml煎煮3次，每次90min。且試驗證明其精密度和穩(wěn)定性良好。用鋁鹽分光光度法測定黃酮的含量,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,操作簡單易行，此法的關(guān)鍵是顯色時間要把握好，一般以11min為宜。所得總黃酮是深棕色物質(zhì)，為方便以后的含量測定，用6

12、0的乙醇定容。初步測得補陽還五湯中總黃酮的含量為41.402mg/ml。提取時間的長短和恒溫水浴溫度的控制，實質(zhì)上是體現(xiàn)在溫度對浸提效果的影響，一方面浸提速度直接與浸提溫度成正相關(guān)，另一方面溫度升高，溶劑的粘度減少，也增大了浸提溫度效率。但是，鑒于有效成分的熱穩(wěn)定性，以及溫度升高時雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，在提取時浸提溫度不能過高，同時也考慮到乙醇的沸點是78.5，溫度過高，乙醇揮發(fā)嚴(yán)重，生產(chǎn)成本增大。因此將恒溫水浴鍋溫度控制在8085之間。本試驗以廉價、安全的乙醇作為提取溶劑，所得樣品有效成分含量高，表明該方法簡便、實用、經(jīng)濟。為補陽還五湯的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供資料和依據(jù)，為補陽還五湯及其它經(jīng)典復(fù)方的創(chuàng)新研究提供一定的參考價值。 參考文獻(xiàn) 1.王晚霞，李榮亨，補陽還五湯作用機制研究進(jìn)展J.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6（5）：574576。 2.紀(jì)松崗,李翔,正交設(shè)計法確定黃芪中黃酮類成分的超聲提取條件.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005,26(10)：1168-1170。 3.范媛媛，李新華，綠豆黃酮提取工藝研究J.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 36(5): 619- 622。 4.蔡碧瓊,余萍，水稻谷殼中總黃酮提取工藝及其性質(zhì)表征.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，36(5)：142-147。 5.蔡凌云,肖娟，白簕葉中黃酮成分的鑒定和含量測定.綿陽師范學(xué)院學(xué)報，2010