1、苦竹葉總黃酮的超聲提取及其抗氧化研究(一)    【摘要】 目的探討苦竹葉中總黃酮的提取、 鑒別方法及對羥自由基的清除能力，以充分利用苦竹葉植物資源，避免資源的浪費。方法采用超聲波乙醇浸提法從苦竹葉中提取黃酮類化合物，用分光光度法測定黃酮類化合物的總含量，并利用對羥自由基的清除能力就苦竹葉總黃酮的抗氧化性進行研究。結果測得樣品中黃酮類化合物的總含量為C=0.407 mg/ml，回收率為100.5%，其純度和產率均較高。結論該方法采用全物理過程，無任何污染，是提取苦竹葉中黃酮類化合物的有效途徑。苦竹葉黃酮類化合物提取液對 Fenton體系產生的·

2、OH自由基有很好的清除作用。 【關鍵詞】 苦竹葉 總黃酮 鑒別 超聲波提取 清除 自由基Abstract：ObjectiveTo study the extraction and identification of total flavanone from Pleioblastus amarus leaves and its effect of scavenging hydroxyl radical. MethodsThe flavonoids were extracted from pleioblastus amarus leaves with ultrasonic wave and eth

3、anol extraction. Spectrophotometry was used to determine the flavanone content of Pleioblastus amarus leaves. The effect of scavenging hydroxyl radicals of total flavanone from Pleioblastus amarus leaves was also studied.ResultsBy this method, the content of the total flavanone of Pleioblastus amaru

4、s leaves was C=0.407mg/ml and the recovery rate was 100.5%. ConclusionThis text provides the extraction and purifying methods to get the outcome and the purity of the flavanone is high. This method is a purely physical process and has no pollution. It is an ideal way to extract the total flavanone o

5、f Pleioblastus amarus Leaves. Total flavanone from Pleioblastus amarus leaves have scavenging effects on hydroxyl radicals.Key words： Pleioblastus amarus leaves; Total flavanone; Identification; Ultrasonic wave treatment; Scavenging; Free radicals苦竹Pleioblastus amarus Keng f.是一種喬本科竹亞科多年生常綠植物，高達幾米至十幾

6、米，常生長在山谷平原或向陽山坡，在我國南方各省市分布廣泛。苦竹用途廣泛1，竹筍、稈、皮、根等均已被開發利用2，3，但苦竹葉多被廢棄。據本草綱目記載，苦竹葉味苦，性涼，無毒。具有醫治口瘡目痛，明目利九竅，治不睡，止消渴，解酒毒，發汗，中風暗啞等4功效。新近研究成果表明，苦竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖及其他有效成分5。黃酮類化合物有明顯的抗潰瘍、解痙、抗菌、抗炎、降血脂和鎮痛等生理作用，還具有較強的清除生物體內超氧自由基的作用等6。苦竹葉黃酮以其巨大的資源優勢，良好的藥理活性和極低的毒副作用，必將成為一種極具開發價值的新型中草藥7。目前，有關提取苦竹葉黃酮的方法8存在提取時間長、溶劑

7、消耗大、提取率低等缺點而超聲提取技術利用超聲波輻射產生的多種作用，可極大地提高提取效率，節約溶劑，同時還可避免高溫對提取成分的影響9。為此，本文首次將超聲技術用于苦竹葉總黃酮的提取當中，同時對黃酮提取物進行體外抗氧化性研究，為大規模提取、開發黃酮類化合物及綜合利用苦竹葉資源提供理論和實驗依據。1 儀器與材料TU-1800紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司生產)； SK2200H型超聲波清洗儀 (上海科導超聲儀器有限公司生產)；SHB-III循環水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿有限公司)；DZK88-A型熱恒溫真空干燥箱 (上海醫療器械七廠生產)；AB-1042型電子分析天平 (梅特

8、勒-托利多上海儀器有限公司)。雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、95%乙醇、氫氧化鈉、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、醋酸乙酯、乙酸鎂、甲醇、鹽酸、氨水、冰醋酸、正丁醇、鎂粉等試劑，均為分析純，并由西安市試劑廠提供。蘆丁標準品 (中國藥品生物制品檢定所)；新鮮苦竹葉采自湖南永州市雙牌縣陽明山苦竹種植基地。2 方法與結果2.1 總黃酮成分提取將苦竹葉洗凈烘干，粉碎，過20目篩，精確稱取苦竹葉粉末10 g，加100 ml 95%乙醇，超聲波提取2.0 h，抽濾。濾渣再加100 ml 95%乙醇，超聲波繼續提取2.0 h，抽濾，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩20 ml左右為止，置250 ml容量瓶中，用6

9、0%乙醇稀釋至刻度，即得樣品液。2.2 測定方法以蘆丁為對照品測定苦竹葉中總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時控制適宜pH值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡合物，在可見光區能獲得穩定的特征吸收峰。2.3 定量實驗-總黃酮的含量測定2.3.1 測定波長的選擇精確量取一定量的樣品液，在堿性條件下，加入0.30 ml 5%亞硝酸鈉溶液，經硝酸鋁顯色后，以試劑為空白參比液，在420700 nm波長范圍測定絡合物的吸光度，結果表明絡合物在510 nm波長處有最大吸收峰出現，故測定時選用此波長為特征吸收峰位置。2.3.2 標準曲線的制作精密稱取蘆丁20 mg，加60%乙醇水溶液定容至100 ml，從中取出25 m

10、l并且用蒸餾水稀釋至50 ml。再分別吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 ml于10.00 ml具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 ml，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁水溶液0.30 ml，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉水溶液4.00 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置 15 min后，以試劑為空白，在510 nm處測吸光度。結果見表1。表1 紫外可見分光光度計測定蘆丁對照液吸光度（略）根據表1可得蘆丁濃度(C)與其吸光度(A)具有良好的線性關系，其線性方程式為：A= 11.210 0C- 0. 002 9, ( r=0.

11、999 9)2.3.3 提取物含量的測定精密吸取樣品液1.0 ml，置 10 ml容量瓶，按標準曲線的制備方法測其吸光度為A=0.454，根據回歸方程： A=11.210 0C- 0.002 9，計算出樣品中總黃酮的含量為C=0.407 mg/ml。2.3.4 回收率實驗精密量取樣品液2.00 ml，加入標準蘆丁對照品2.00 ml (0.125 mg/ml)，同前樣品測定方法操作測定吸光度，求得的回收率為100.5%。2.4 定性實驗-總黃酮的鑒別2.4.1 顏色反應三氯化鋁反應：取樣品溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干。在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點。鹽酸-鎂粉反

12、應：取乙醇提取液1ml于試管中加鎂粉，再加入濃鹽酸數滴 (1次加入)，在泡沫處呈紫紅色。紫外光下呈色反應：取該樣品溶液點在濾紙上，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈灰褐色并有熒光斑點。乙酸鎂反應：取樣品溶液點在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黃色斑點。濃氨水反應：取該樣品溶液點在濾紙上，將濾紙在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下觀察，呈極明顯的黃褐色熒光斑點。2.4.2 紙層析取樣品溶液15 l點在濾紙上。用正丁醇乙酸水= 415(體積比)為展開劑，上行展開6 h，取出晾干，噴1%氯化鋁乙醇溶液，吹干后于紫外光下，可見熒光斑點。2.5 總黃酮提取物對·OH的清除作用 羥

13、自由基是對機體危害最大的自由基，是氧化性極強的氧化劑，它不僅是膜脂質過氧化的罪魁禍首，而且還一直被認為是引起DNA損傷的重要因素。實驗時常Fenton反應產生·OH， 反應使用的H2O2量與產生的·OH量成正比，當給予電子受體后，用試劑顯色形成紅色物質，其呈色程度又與·OH量成正比。因此可利用Fenton反應機理建立反應體系模型10，利用H2O2與 Fe2+混合產生·OH，若在反應體系中加入水楊酸，就可有效地捕捉·OH，并產生有色產物，該反應的方程式可描述如下： H2O2+Fe2+Fe3+·OH+OH-所得產物在510 nm處有強吸收

14、，若在此反應體系中加入同樣具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產物生成量減少。實驗時采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系( 8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+ l ml，9mmol/L 1ml水楊酸-乙醇溶液 )中加入一系列不同濃度的苦竹葉總黃酮提取液，并以蒸餾水為參比，與試劑空白液進行比較，在510nm處測量不同濃度下的吸光度，便可測定出被測物(總黃酮 )對·OH的清除作用，其清除率計算公式如下：清除率（）A0-AxA0×100其中，Ao為空白對照液的吸光度，Ax為加入不同濃度的苦竹葉總黃

15、酮提取液的吸光度。以實驗的提取液總黃酮作為待試樣品，分別取不同體積的提取液定容到 10 ml，并分別測其對·OH的清除作用，結果見圖1所示。從圖1中可看出，苦竹葉總黃酮提取液對由 Fenton體系產生的·OH有很好的清除作用，隨著苦竹葉總黃酮提取液濃度的上升，對·OH自由基的清除能力也隨之增強，說明苦竹葉中黃酮類物質有很好的清除羥基自由基的能力和正線關系。3 討論實驗結果表明，超聲波輔助提取苦竹葉黃酮類物質的方法，所得產品純度高，回收率為100.5%。與常規乙醇提取法相比，超聲波可以強化乙醇浸提法，達到省時、高效、節能的目的，而且新方法采用全物理過程，無任何污染，

16、工藝過程簡單，是一條理想的提取黃酮類物質的途徑，具有廣闊的應用前景。黃酮類化合物是一大類天然產物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，具有很高的藥用價值。在自然界中最常見的是黃酮醇和黃酮，其余結構還包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等6。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，進入脂肪組織，進而表現出諸多功能，如消除疲勞、保護血管、防止動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細胞等等。因此黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、

17、抗衰老、抗輻射等功效11，12。近年來，世界各地掀起了植物藥開發的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點備受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目，苦竹葉分布廣泛。本文實驗結果表明，苦竹葉中不僅含有豐富的黃酮類化合物，而且其內含的黃酮物質對羥自由基具有很好的清除能力。因此，苦竹葉具有廣泛開發和利用價值，值得加強資源開發和綜合利用。【參考文獻】1耿伯介.中國植物志，第九卷，第分冊M.北京:科學出版社，1996:2.2張良,陳鄭殯.山地之寶-苦竹J.植物雜志,2002,27(2):26.3劉發萬,楊敏杰,龔亞菊,等.筍中之寶-苦竹筍J.中國野生植物資源，2003，22(2):526.4張佐玉,張喜.竹子在中醫藥和保健品開發中的潛力J.世界科學技術，2000，2(3):56.5余學軍,劉力,金愛武,等.苦竹葉制茶主要營養成分的變化J.浙江林學院學報，2003，20(1): 63.6張英,吳曉琴,俞卓裕.竹葉和銀杏葉總黃酮含量及其抗自由基活性的比較研究J.中國中藥雜志,2002,27(4):254.7李水福,王如偉,陳琴鳴.淺談竹類的藥用