1、武輝張思仲肖翠英 【摘要】 目的 為了消除PCR擴增三核苷酸重復序列時產生的影子帶。方法 以人 類強直性肌營養不良致病基因-肌張力蛋白激酶基因(myotonin protein kinase gene, MT-PK)3端非翻譯區中的CTG重復序列為例，主要比較了PCR反應中單獨使用Taq DNA聚 合酶和使用TaqPwo混合的DNA聚合酶對影子帶產生的影響。結果 實驗表明PCR反應中 單獨使用Taq DNA聚合酶時，其PCR產物經PAGE電泳，銀染顯色后常有影子帶形成，而向 Taq DNA聚合酶中加入具有3-5外切酶活性的Pwo DNA聚合酶則可完全消除影子帶。 結論 本實驗結果表明影子帶產生

2、于PCR過程本身，而比Taq DNA聚合酶具有更高加工性 的組合酶則有可能消除或減弱影子帶。 【關鍵詞】 聚合酶鏈反應影子帶三核苷酸重復序列 SHADOW BANDS IN PCR AMPLIFICATION OF TRINUCLEOTIDE REPEATS AND THEIR ELIMINATIONWu Hui, Zhang Sizhong*, Xiao Cuiying.*Department of Medical Genetics,West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041 【Abstract】 Objective

3、To explore a method for eliminating the shadow bands in PCR amplification of trinucleotide repeats.Methods CTG trinucleotide repeat sequence in the 3-untranslated region of the human myotonin protein kinase gene was used as templates DNA in PCR amplification, and the effectsof Taq DNA polymerase alo

4、ne and its mixture with Pwo DNA polymerase on occurrence of theshadow bands were compared. The PCR products containing (CTG)5, both from Taq DNA polymerase and from TaqPwo polymerase amplification, were cloned into pBluecript KS and sequenced on ALFexpressTM DNA sequencer respectively. Results The P

5、CR of DNA sequence containing CTG repeatsfrequently produced a main band (usually darker) and a shadow band (lighter) that differed from the main band by 3 base pairs when Taq DNA polymerase was used alone. However, when the mixture of TaqDNA polymerase and Pwo DNA polymerase was used, the shadow ba

6、nds usually disappeared. In the 4 clones containing PCR products amplified by Taq DNA polymerase, one clone contained only 4 CTGrepeats. However, this kind of decrease of repeat copy was not observed in the 5 clones containing PCRproducts amplified by using mixture of TaqPwo DNA polymerase. Conclusi

7、on The results of this experiment demonstrate that shadow bands occur during the PCR. Pwo DNA polymerase in known to possess not only DNA polymerase activity, but also 3-5 exonuclease activity, or proofreadingability. The mixture of Taq DNA polymerase and Pwo DNA polymerase has higher processivity t

8、hanTaq DNA polymerase itself. This may explain the effect on eliminating or reducing the occurrence of shadow bands in polymerase chain reaction. 【Key words】 Polymerase chain reactionShadow bandsTrinucleotide repeats DNA重復序列的檢測在人類DNA多態研究和連鎖分析中占有重要的位置。諸如三核 苷酸重復等大量微衛星DNA即可作為遺傳標記使用，某些短重復序列的異常在遺傳疾病 和腫瘤發

9、生中還具有病因學意義。因此短重復序列的PCR擴增和檢測已成為許多實驗室 的日常工作。然而，在重復序列的PCR擴增產物的電泳檢測時，除主帶外常可見一些顯 色較淺的影子帶1，后者常使等位片段的判讀產生困難，從而影響對結果的正確分 析和臨床診斷。如何消除這些影子帶一直是許多研究者關注的問題，而迄今尚未見較 系統的研究和如何避免影子帶產生的報道。有鑒于此，我們以人類強直性肌營養不良 致病基因-肌張力蛋白激酶基因(myotonin protein kinase gene,MT-PK)3端非翻譯 區中的CTG重復序列為材料，重點考查了PCR擴增時不同聚合酶或酶的組合對影子帶產 生的影響，并根據實驗的結果就

10、影子帶產生的機理進行了討論。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 1.1.1 62例標本為本室采集的非相關正常人標本，年齡2054歲。圖1標本系其中的4 個樣品，且每組比較的結果均分別來自對同一個體的同批DNA標本PCR擴增的結果。 1.1.2 寡核苷酸引物 參照Mahadevan等2合成。其序列為：正向引物： 5-GCTCGAAGGGTCCTTGTAGCC-3；反向引物：5-GGGGGTGCGTGGAGGATGGAA-3。引物 分別位于19q13.3上的MT-PK基因3非編碼區中的CTG重復序列兩側，該重復區在正常群 體中呈高度多態24。 1.1.3 外周血DNA按常規方法制備5。 1.1.4

11、 耐熱DNA聚合酶 Taq和Pwo DNA聚合酶分別購自BRL和Boehringer Mannhein公司。 1.2 實驗方法 1.2.1 PCR擴增 PCR擴增按常規方法。在PE-9600型擴增儀上進行。反應體積為50l， 內含10mmolL Tris-Cl(pH8.8)，25mmolL KCl，5mmolL(NH4)2SO4，1.5mmolL MgCl2，200molL dNTP，300nmolL引物，50ng模板DNA，Taq DNA聚合酶或TaqPwo 混合酶(51) 1.5U。在95預變性8分鐘，進入循環。循環條件為：94 30秒，60 30秒， 72 20秒，共30個周期。最后在7

12、2延伸7分鐘。每批反應均設置陰性對照，即反應 系統中以等體積滅菌超純水代替模板DNA。 1.2.2 PCR產物的電泳檢測 電泳用BRL公司的丙烯酰胺凝膠按丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 191的比例制成8%的非變性膠板，PCR產物中加入16體積的上樣緩沖液后，每次取等 量產物液(25l)，點樣于相應的上樣孔。電泳在V16電泳儀(BRL)上進行，在300V， 1520mA條件下，電泳3.5小時后，用銀染法6，即先將凝膠在10%乙醇中浸泡5分鐘 后，用1%硝酸處理5分鐘，雙蒸水沖洗后，浸于0.2%硝酸銀中20分鐘，用純水沖洗3次， 最后用3%碳酸鈉(含0.019%甲醛)顯影，至各帶清晰可見后，用5%醋酸停顯

13、并照相記錄。 1.2.3 應用兩種DNA聚合酶的PCR產物的序列分析 用于測序的PCR產物通過下列反應制 備，PCR反應總體積為100l，內含100ng DNA模板，3U Taq DNA聚合酶或3U TaqPwo DNA聚合酶(51)，其余條件如前1.2.1所述。PCR產物的回收及純化采用Qiagen公司的 PCR產物純化試劑盒，按使用說明書進行。純化的PCR產物按本室新進發展的同端化PCR (UT-PCR)的方法7進行擴增。擴增產物經BamHI酶切后，按Sambrook等5的方法克 隆至pBluescript KSBamHI質粒中，然后轉化到大腸桿菌JM107，挑取白色菌落進行 培養擴增、酶

14、切鑒定。陽性克隆再經培養擴增，用堿裂解法提取質粒DNA。重組質粒DNA 的雙鏈測序用Pharmacia公司的Cy5 AutoReadTM測序試劑盒，按說明書建議的方法略加改 進后，在ALFexpressTMDNA測序儀上進行。 1.2.4 特異性PCR產物的確定 各條電泳帶均依照主帶的位置，參照分子量大小標記 (pBR322Hea，外添158bp的PCR產物)確定。隨機挑選部分按電泳確定了片段大小的PCR 產物標本進行測序，結果其PCR產物的特異性及片段大小與測序結果完全一致。 2 結果 2.1 PCR產物電泳后的銀染結果 62例正常個體的MT-PK基因3非編碼區的CTG三核苷酸 重復序列的P

15、CR擴增結果表明：單獨使用Taq DNA聚合酶時，在絕大多數情況(2022)在 主帶下方出現了影子帶，后者與主帶的位置相差3bp(參照分子量大小標記)。而采用 TaqPwo DNA聚合酶(51)則未見影子帶的產生(4040)。應用Taq DNA聚合酶和 TaqPwo DNA聚合酶的結果比較見圖1。圖1中、為雜合子(5和15拷貝CTG的等位片 段)，、為純合子(分別為13和5拷貝CTG的等位片段)，其中2、2、2、2在 主帶下均可見有一條影子帶，而1、1、1、1在主帶附近均無影子帶。圖2顯示 其中10個樣本用TaqPwo DNA聚合酶的擴增結果。 2.2 比較兩種DNA聚合酶的PCR產物的序列分

16、析結果 對上述 DNA樣品分別使用了Taq DNA聚合酶和上述的混合酶，采用1.2.3中所述方法對二者的PCR產物分別進行測序。結 果在使用Taq DNA聚合酶的PCR產物重組質粒的5個陽性克隆中發現了1個CTG為4拷貝的 克隆(15)。而使用上述混合酶擴增后，選出的6個陽性克隆中，CTG拷貝數全為5(圖 3)。由于采用了相同的DNA模板，這一結果支持影子帶產生于PCR反應過程中，而似與 模板的異質性，即有無突變細胞關系不大。 3 討論 影子帶的存在一直是困擾分子生物學實驗工作者的問題，如何消除影子帶，迄今 仍未見有滿意的方法報道。一般認為采用加有甲酰胺或尿素的聚丙烯酰胺凝膠電泳可 減少其出現

17、8。此外我們過去也曾通過銀染 圖1 (左)4個不同個體CTG區域分別用Taq和TaqPwo DNA聚合酶PCR擴增的電泳銀染結 果 Taq DNA聚合酶擴增的樣本：2、2、2、2，在主帶下可見一條影子帶。1、 1、1、1為TaqPwo DNA聚合酶PCR擴增的結果，1和2、1和2、1和2、 1和2分別為同一個體的同批DNA樣本，M為pBR322Hae158bp的PCR產物 圖2 (右)用TaqPwo DNA聚合酶擴增11個不同個體樣本的結果，除主帶外，均見不到 影子帶，M為pBR322Hae158bp的PCR產物 Fig 1 (left) The PCR of 4 DNA samples co

18、ntaining CTG region by using Taq and TaqPwo DNA polymeraserespectively The silver stain detection after PAGE electrophoresis indicates that by using Taq DNA polymerase,the samples2,2,2 and 2 show shadow bands(lighter) below a mainb and, however,by using TaqPwoDNA polymerase 1,1,1,1 do not show the s

19、hadowbands. M denotes pBR322Hae158bp PCRproduct. Fig 2 (right) The PCR analysis of 11 individuals DNA samples by using the mixture of TaqPwoDNA polymerase It only shows the specific main bands detected by silver stain after PAGE electrophoresis. M denotes pBR322Hae 158bp PCR product 圖3 3a、3b為采用TaqPw

20、o DNA聚合酶擴增后，其產物克隆至載體，其中的兩上陽性 克隆所測CTG重復序列及其兩側部分序列的結果，3c為單獨使用Taq DNA聚合酶擴增后， 在5個陽性克隆中所發現的一個CTG拷貝數為4的測序結果 Fig 3 The sequencing analysis of PCR products containing 5 CTG repeats. 3a and 3b indicate CTG region, whichcome from 2 clone in 6 clones that contain the PCR products by using TaqPwo DNA polymerase

21、. 3c indicatesthat one 4 copies which comes from one clone in 5 clones that contain the PCR products by using Taq DNA polymerase. 顯影時間和控制PCR的DNA模板量及延伸時間，來控制影子帶的出現9，但效果仍不 很理想。我們的實驗結果表明：在PCR擴增三核苷酸重復序列中，單獨使用無3-5 外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶常有影子帶形成，實驗同時也證實了影子帶是PCR過 程中產生的。Pwo DNA聚合酶具有35的外切核酸酶活性，即具有“校讀”的功 能。當將這兩種酶以

22、一定比例混合使用時，可以提高PCR的擴增效率(本文未示實驗結 果)。類似DNA聚合酶的組合在進行長的和精確的PCR(long and accurancy PCR)中被采 用10，但未見將此種組合酶用于消除影子帶研究的報道。本實驗中我們發現：使用 這種混合酶，即使用高靈敏度的銀染顯示方法在主帶附近也未出現影子帶。 關于影子帶成形機理，Muray等在研究CA二核苷酸重復序列的PCR擴增時認為，CA 重復序列區中2bp的隨機缺失所導致的影子帶可能是DNA鏈在復制過程中的滑動(slippage) 所致，并曾設想一種高效(high processity)的DNA聚合酶可以降低影子帶的產生1。 Hauge

23、等也認為PCR過程中“滑動鏈的錯配”(slipped strand mispairing)是影子帶產 生的主要機制11。我們采用了兩種不同DNA聚合酶體外擴增正常人模板DNA，我們報 告的結果也表明影子帶的出現是由于PCR擴增的結果，同時排除了我們曾經推測影子帶 是由于體細胞變異所致。由此推測在PCR擴增三核苷酸重復序列區時所見的影子帶也是 DNA鏈滑動的結果，即與PCR擴增二核苷酸重復序列區時相似。而在PCR擴增中使用Taq DNA 聚合酶與上述具有“校讀”功能的聚合酶的混合物可以避免PCR擴增三核苷酸重復序列 區時影子帶的產生。一般說來，PCR擴增二核苷酸重復序列區時更易產生影子帶，上述

24、方法能否消除其影子帶還須進一步驗證。除使用上述的組合酶及PCR緩沖液外，如同時 考慮使用較低的循環周期數及引物的重設計因素，至少能在一定程度上控制PCR擴增二 核苷酸重復序列區影子帶的產生。 本課題受國家自然科學基金(39570388)及衛生部科學基金資助 作者單位：610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院醫學遺傳研究室 參 考 文 獻 1 Murray V, Chutima M, England PR. The determination of the sequences present in the shadow bandsof a dinucleotide repeat PCR. N

25、ucleic Acids Res, 1993,21(10)2395-2398. 2 Mahadevan M, Amemmiya C, Jansen G, et al. Myotonic dystrophy mutation: An unstable CTG repeatin the 3untranslated region of the gene. Science, 1992,255(5049)1253-1255. 3 Brook JD,Mc Currach ME, Harley HG. Molecuar basis of myotonic dystrophy: Expansion of atrinucleotide(CTG) repeat at the 3end ofa trancript encoding a protein kinase family member. Cell,1992,68(4)799-808. 4 Mahadevan M, Amemmiya C, Jansen G, et al. Strcture and genomic sequence of the myoto dystrophy(DM kinase) gene. Hum Mol Genet,1993,2(3)299-304. 5 Sambrook J, Fritsch EF, Mani