1、1第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)一、 細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理2細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細(xì)胞在體外環(huán)境存活、生長增殖，并維持其結(jié)構(gòu)功能。3培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點4 貼壁型細(xì)胞： 必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞5按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型6v 成纖維細(xì)胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細(xì)胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞。 789v 上上皮型細(xì)胞細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有

2、圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，生長時呈膜狀移動，起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 10111213v 游走細(xì)胞型在支持物上呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。v 多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 1415懸浮型細(xì)胞： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細(xì)胞和血液淋巴細(xì)胞16o培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長o 來自血，脾或骨髓o 在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個

3、或小細(xì)胞團(tuán)o 生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)o 觀察不方便1718培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程 19v 培養(yǎng)細(xì)胞生命期培養(yǎng)細(xì)胞生命期所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。 2021o 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)期：期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強。細(xì)胞獨立生存性差。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞

4、性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。 22o 傳代期：傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。反復(fù)傳代就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。 23o 衰退期：衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的

5、影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。24v 培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第n代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代n次。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。細(xì)胞傳一

6、代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：25潛伏期（游離期，貼壁期）對數(shù)生長期停止期（平臺期）26 潛伏期：潛伏期：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。 27 初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)1024小時或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，1030分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，細(xì)

7、胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。28初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約2496小時或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅624小時；細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。293031指數(shù)增生期：指數(shù)增生期：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤

8、細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。 32特點：特點：是細(xì)胞是細(xì)胞增生最活躍增生最活躍、活力最旺盛活力最旺盛的階段的階段培養(yǎng)物中培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長, ,細(xì)胞群體均一細(xì)胞群體均一是理想的實驗用細(xì)胞是理想的實驗用細(xì)胞33在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。34 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增

9、多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。35停滯期：停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。3637培養(yǎng)細(xì)胞的體外生長環(huán)境38v 無污染環(huán)境39超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 40濾 器41壓力蒸汽消毒器：壓力蒸汽消毒器

10、：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒 濾器：濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 42v 基 質(zhì)玻璃基質(zhì)塑料飼養(yǎng)細(xì)胞生物性基質(zhì)處理培養(yǎng)表面金屬4344v 氣體環(huán)境和氫離子濃度Hepers 緩沖液CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-CO2: 5%45v 液相環(huán)境46水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 47天然培養(yǎng)基天

11、然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié) 果的分析。 易發(fā)生支原體污染 48合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 49 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需

12、補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 50血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分51無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。52v 溫度v 滲透壓53二、 細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法54無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù) 55 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)

13、成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 56v 培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。57v 培養(yǎng)室的消毒 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。些操作用具如移液器、

14、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。58v 洗手和著裝 原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 59v 培養(yǎng)過程中的無菌操作 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。 進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 60基本培養(yǎng)操作技術(shù)基本培養(yǎng)操作技

15、術(shù) 61v 培養(yǎng)細(xì)胞的取材與分離取材部位準(zhǔn)確嚴(yán)格無菌操作盡快培養(yǎng)減小損傷制備標(biāo)本62分散組織 機械分離法 消化分離法63v 培養(yǎng)細(xì)胞的純化人工純化（酶消化法，機械刮除法，反復(fù) 貼壁法，克隆法等）自然純化64v 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。 65低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果

16、。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。66凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。67常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法 68原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞

17、在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 69細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制 70v 微生物污染空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本71 微生物污染的檢測細(xì)菌和真菌的污染和檢測細(xì)菌和真菌的污染和檢測 肉眼直接觀察法肉眼直接觀察法 培養(yǎng)檢查法培養(yǎng)檢查法 顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法727374支原體的污染和檢測支原體的污染和檢測造成支原體高污染率的原因： 1.支原體大小0.10.8 um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）；）； 2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3

18、.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式； 4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染； 5.研究或操作人員忽略污染問題； 6.已受污染的細(xì)胞； 7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。75支原體之檢測：支原體之檢測：相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法 PCR方法767778 微生物污染的控制抗生素除菌法加溫處理79v 化學(xué)污染v 細(xì)胞交叉污染80第二節(jié) 口腔醫(yī)學(xué)中相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)及其特點一、 牙齒相關(guān)細(xì)胞81牙髓細(xì)胞82培養(yǎng)中的細(xì)胞成分： 成纖維細(xì)胞 未分化的間充質(zhì)細(xì)胞83v 培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)84v 細(xì)胞形態(tài)特點85v 免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性

19、角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞 原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性86v 生長增殖特點成功率快速增殖期死亡87v 功能特點堿性磷酸酶活性礦化現(xiàn)象對鈣調(diào)節(jié)因子的作用對細(xì)胞因子的反應(yīng)對氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應(yīng)88牙周膜細(xì)胞89v 培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)90培養(yǎng)中的細(xì)胞成分： 成纖維細(xì)胞 未分化的間充質(zhì)細(xì)胞91v 細(xì)胞形態(tài)特點92v 免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞 原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性93v 生長增殖特點成功率快速增殖期死亡94v 功能特點分泌功能礦化功能收縮功能附著能力再生能力95v 增殖分化影響因素生長因子胰島素纖維粘連蛋白抗壞血酸羥基磷灰石96

20、二、唾液腺細(xì)胞97v 細(xì)胞形態(tài)特點腺泡上皮細(xì)胞導(dǎo)管上皮細(xì)胞肌上皮細(xì)胞98v 免疫組織化學(xué)染色腺泡上皮細(xì)胞：角蛋白、淀粉酶、對氨基水楊酸、導(dǎo)管上皮膜、 前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應(yīng)導(dǎo)管上皮細(xì)胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應(yīng)肌上皮細(xì)胞： 肌動蛋白、S100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應(yīng)99v 功能特點分泌功能腺泡細(xì)胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等腺泡上皮細(xì)胞：頂端分泌、基底及側(cè)膜分泌導(dǎo)管細(xì)胞：膠原肌上皮細(xì)胞：膠原100v 唾液腺細(xì)胞的增殖分化基底潛能干細(xì)胞理論單細(xì)胞全能干細(xì)胞理論雙細(xì)胞亞全能干細(xì)胞理論101v 增殖分化功能影響因素細(xì)胞因子激素細(xì)胞外基質(zhì)鈣離

21、子102三、口腔粘膜細(xì)胞103v 培養(yǎng)方法組織塊法酶消化法104v 細(xì)胞形態(tài)特點105v 免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陰性多種角蛋白表達(dá)陽性106v 功能分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白 金屬蛋白酶107四、頜骨相關(guān)的硬組織細(xì)胞108破骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點組織化學(xué)染色特點功能109成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點免疫組織化學(xué)染色特點功能：成骨作用對破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用110軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點組織化學(xué)染色特點功能影響軟骨細(xì)胞功能分化的因素111五、口腔腫瘤細(xì)胞112v 培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)

22、的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。 113形態(tài)和性狀形態(tài)和性狀 培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。 114生長增殖生長增殖 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（25）仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中

23、生長的現(xiàn)象，已成為檢測細(xì)胞惡變的一個指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。115永生性永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀。116浸潤性浸潤性 浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。117異質(zhì)性異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤

24、內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。118細(xì)胞遺傳細(xì)胞遺傳 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。 119v 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。

25、 120口腔鱗癌細(xì)胞：舌鱗狀細(xì)胞癌系涎腺腫瘤細(xì)胞：人黏液表皮樣癌系 腺樣囊性癌系來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性121第三節(jié) 口腔組織工程與干細(xì)胞一、 組織工程的基本原理122123修復(fù)缺損器官的方法修復(fù)缺損器官的方法自體移植自體移植異體移植異體移植組織代用品組織代用品124組織工程的基本原理和方法組織工程的基本原理和方法 組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖,擴增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù).125126組織工程的核心問題是：組織工程的核心問題是：建立由細(xì)胞和生物材

26、料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體127優(yōu)點：形成具有生命力的活體組織用最少量的組織細(xì)胞修復(fù)大塊組織缺損任意塑形128組織工程的關(guān)鍵技術(shù)組織工程的關(guān)鍵技術(shù): : 組織構(gòu)成細(xì)胞的培養(yǎng) 生物組織是由實質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。對于組織工程來說，首先要求獲取所要培養(yǎng)組織的細(xì)胞。細(xì)胞可來源于自體細(xì)胞，這是一種較常規(guī)的選擇，可以避免機體的免疫排斥反應(yīng)，但是受到種類、數(shù)量、時間等限制。因此必須考慮其它方式來獲取細(xì)胞，如應(yīng)用治療性克隆技術(shù)從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成組織特異干細(xì)胞或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得工程細(xì)胞。獲取細(xì)胞后，還要研究細(xì)胞擴增防老化技術(shù)及其機理，干細(xì)胞快速、規(guī)模擴增等問題。 129生物材料及構(gòu)架制備 為了形成具有三維結(jié)

27、構(gòu)的組織，必須提供一個構(gòu)架，構(gòu)架選擇的聚合體必須有足夠的彈性提供細(xì)胞一個類似生命體的力學(xué)環(huán)境，充分多的孔隙允許培養(yǎng)液浸潤生長的組織，傳輸營養(yǎng)物質(zhì)和清除細(xì)胞代謝廢物，隨著組織的生長能夠自我降解，但是降解速度不能太快，要有足夠的時間保證細(xì)胞長進(jìn)去，及時填補聚合體溶解留下的空隙。所以必須用多分支的、多孔滲水的聚合物材料制作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，常用的有聚羥基乙酸、聚乳酸類等生物材料。 其關(guān)鍵技術(shù)主要包括基體材料改性、表面修飾、表面活性組裝、降解速率調(diào)控、三維構(gòu)架設(shè)計和制備等等。130良好的生物相容性生物降解性良好的表面活性具有多孔性組織工程支架材料的要求：131生物組織工程化培養(yǎng)系統(tǒng)的研究 力學(xué)環(huán)境(微環(huán)境應(yīng)力分布)是誘導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞功能分化，影響細(xì)胞能動運動、粘附、聚集以及細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而決定其生物圖式的構(gòu)成的重要因素。 另一方面，細(xì)胞