1、Micro RNA在基因表達調控中的作用在基因表達調控中的作用一一.怎樣定義怎樣定義miRNA(成熟成熟)1, 長度為22nt的轉錄體.可通過northern blot等方法檢測得到.2,其前體為典型的發卡結構.miRNA位于發卡結構的莖部分.3, 通過Dicer酶的處理后生成.4,序列具有高度的保守性.二二.miRNA.miRNA的生成過程的生成過程注意事項注意事項: 1,通過RNA聚合酶II轉錄生成.具有mRNA的結構特征 2,可以是多順反子結構.即一條pri-miRNA包含多個成熟 miRNA的信息. 3,在判斷一非編碼蛋白質的mRNA是否生成miRNA時,我們可以通過抑制Drosha的

2、活性,觀察pri-miRNA的含量是否增加.4,miRNA可來源于外顯子,也可來源于內含子和非編碼序列.5.miRNA在基因組DNA上成族分布,處于同一族的miRNA常共表達三三. miRNA. miRNA 的作用機制及功能的作用機制及功能 作用機制作用機制:與靶基因mRNA 3-非翻譯區通過不完全配對結合降低mRNA穩定性或抑制靶基因的 翻譯.此外, miRNA也可與5-非翻譯區和編碼區序列結合調節靶基因的表達. 有文獻報道,miRNA可與mRNA3-非翻譯區的其他部位結合,升高mRNA的穩定性.注意事項注意事項: 1, 由于miRNA與靶序列是通過不完全配對結合,因此證實miRNA的靶基因

3、成為一難點. 2,一種miRNA常有多個靶基因.功能功能: miRNA 主要通過抑制它的靶基因來起調控作用。miRNA 的作用遍及生命體的發生、生長、發育、分化和死亡的過程。 Lewis 等人的預測結果發現，預測的 miRNA 的靶基因多數是參與轉錄、信號轉導、腫瘤發生的基因。雖然 miRNA 的作用也是特異的，特別是5端的28個堿基，特異性的靶向與它的靶基因，但是與 siRNA 不同的是 miRNA 的特異性并不是那么強，在生物體內往往一個 miRNA 作用于多個靶基因 6. 對于同一家族miRNA,其功能常具有互補作用.比如: 在MYC誘導的B細胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族

4、DNA序列可誘導凋亡,如果導入此族中的任意一種miRNA均可減輕細胞凋亡.7. 不同miRNA可同時調節同一靶mRNA1.miRNA與細胞增殖與細胞增殖apoptosis轉錄因子轉錄因子p53miR-34aStress(H2O2,UV等)Proinflammatory cytokine轉錄因子轉錄因子NF-kBmiR-146(1) IL-1 receptor- associated kinase 1 (2) TNF receptor- associated factor 6抑制cytokine signaling2.miRNA與細胞凋亡與細胞凋亡3.miRNA與細胞信號傳導與細胞信號傳導四四.

5、microRNA.microRNA表達的特點表達的特點1,1,時間特異性時間特異性在高等生物,microRNA的表達在生長發育的不同階段是不同的.2,2,組織特異性組織特異性在不同的組織中, microRNA的表達不同的四四.尋找尋找 miRNA 基因基因 1. Forward genetics2. MiRNA cloning3.Computational approaches to miRNA discovery五五. .檢測檢測 miRNAmiRNA 表達的方法表達的方法 1, Northern 雜交 2, Real-time RT-PCR 3. 基因芯片的方法六怎樣預測六怎樣預測miRN

6、AmiRNA的靶基因的靶基因第一種方法第一種方法: 過表達或抑制miRNA的表達,利用基因芯片篩選出差異表達基因.從這些差異表達的基因中,證實miRNA的靶基因.注意事項注意事項: 1.并非所有的差異表達基因都是并非所有的差異表達基因都是miRNA的靶基因的靶基因.許多差異基因表達的改變是由靶基因表達的改變而引起.miRNA轉錄因子p53P53的靶基因P53的靶基因不是該miRNA的靶基因2.該方法不能證實該方法不能證實miRNA所有的靶基因所有的靶基因.根據miRNA與靶基因mRNA 3UTR的配對程度不同, miRNA可降解靶基因mRNA(配對程度高),也可不降解靶基因mRNA (配對程度

7、低) 但抑制mRNA的翻譯,第二種方法第二種方法: 由生物信息學預測miRNA的靶基因.預測miRNA靶基因的網站: /mammalian/index.html. / /microrna/home.do /注意事項注意事項: 根據背景知識, 選擇兩個或兩個以上網站均有預測的靶基因做進一步分析七怎樣證實七怎樣證實miRNAmiRNA的靶基因的靶基因5UTR3UTRORFAAAAAAAAA靶基因靶基因mRNAPCR擴

8、增擴增3UTR克隆克隆3UTR到報告基因到報告基因luciferase下游下游luciferase3UTR報告載體報告載體將重組載體轉染細胞將重組載體轉染細胞,觀察過表達或抑制觀察過表達或抑制miRNA后后,luciferase活性是否改變活性是否改變.為進一步證實為進一步證實miRNA確實調節該靶基因確實調節該靶基因,還需完成以還需完成以下實驗下實驗1,突變突變3UTR 上與上與miRNA結合序列結合序列(主主要是種子序列要是種子序列),觀察觀察突變后的突變后的3UTR 可否可否廢除廢除miRNA對對luciferase活性的影活性的影響響2,觀察過表達或觀察過表達或抑制抑制miRNA后后,

9、內內源性靶基因源性靶基因mRNA和蛋白質和蛋白質水平是否相應改水平是否相應改變變.3,miRNA與靶基因與靶基因功能相關性的研究功能相關性的研究八八. miRNA表達調控與腫瘤表達調控與腫瘤1. miRNA在基因組DNA上拷貝數的改變(擴增,轉位和缺失) 比如: (1) 在B-CLL中, miR-15a/16-1族區域DNA出現缺失. (2) 在淋巴瘤細胞中, miR-17-92族區域DNA出現擴增. 在膠質細胞瘤中, miR-26a出現擴增 (3) 在T-ALL中, miR-17-92出現轉位.2. miRNA合成的影響3. miRNA的轉錄調控(1)轉錄因子對miRNA的調節作用.(2)DNA