1、肌瓣包裹自體氣管移植體復合BMP誘導軟骨再生    作者：盧強，李小飛，程慶書，王小平，韓勇，王律，汪健，閆小龍    【關鍵詞】 氣管/移植    BMPinduced cartilage regeneration in tracheal autograft with muscular wrapping 【Abstract】 AIM: To study the regeneration of cartilage by rhBMP2 in tracheal autograft

2、 with muscular wrapping. METHODS: Fifteen mongrel dogs were randomly and equally divided into 3 autotransplanted groups: group wrapped with muscle (Group A), group wrapped with muscle and implanted with rhBMP2 (Group B) and group with no treatment (Group C). A fivering cervical tracheal segment was

3、harvested as the autograft. The animals were sacrificed at 1, 2, 4, 8 and 10 weeks postoperative. The general conditions of animals, gross and histological character of the specimens and microvessel density were examined and modified CaCo method was used to detect alkaline phosphatase (ALP). RESULTS

4、: Little regeneration of cartilage was found in Group C while obvious regeneration of cartilage was found in Group A and Group B. Significant difference was found in ALP within 8 weeks after operation between the three groups, with Group B the highest, followed by Group A and then Group C, while no

5、significant difference was found in ALP 8 weeks after operation between the 3 groups. CONCLUSION: Local use of bone morphogenetic protein (BMP) may upregulate ALP in tracheal cartilage and inhibit the absorption of tracheal cartilage. Muscle wrapping can increase the microvessel density and RhBMP2 h

6、elps to maintain tracheals structure. 【Keywords】 trachea/transplantation; alkaline phosphatase; bone morphogenetic protein2; muscular wrapping 【摘要】 目的：研究BMP復合肌瓣在自體移植中對軟骨再生的作用方法：將15只雜種犬隨機等分為3組，均切取頸部5環氣管段作為移植段，行自體移植A組：肌瓣包裹組；B組：肌瓣復合BMP/I型膠原復合物組；C組：空白對照組術后1，2，4，8及10 wk處死動物取材，觀察和比較實驗動物存活情況、移植體氣管標本的大體和組織學

7、改變，新生微血管密度（MVD）等指標，用改良鈣鈷法測定軟骨組織中堿性磷酸酶（ALP）的分布結果：A, B組移植體均有不同程度的軟骨再生：C組基本無再生；B組最明顯術后8 wk前，ALP染色陽性面積有統計學意義（t=3.269，P<0.05），在術后8 wk以后其差別無統計學意義結論：BMP可提高移植段軟骨的ALP表達，抑制軟骨吸收肌瓣包裹移植段，能夠誘導出新生血管，利于軟骨再生，二者復合可有效促進軟骨再生. 【關鍵詞】 氣管/移植; 堿性磷酸酶; 骨形態發生蛋白; 肌瓣0引言氣管移植由于軟化及血供等難題無法臨床應用我們前期研究表明：局部應用骨形成蛋白（BMP）可誘導出移植段新生軟骨，抑制

8、其吸收1，但效果不滿意我們采用肌瓣包裹自體移植段，促進其血液循環及軟骨再生，并復合BMP行自體移植研究，同時局部觀察堿性磷酸酶（ALP）活性的變化，明確BMP抑制軟骨吸收、促進再生，維持氣管形態的機制 1材料和方法 1.1材料 rhBMP2（第四軍醫大學基礎部生物化學教研室）；I型膠原（華美生物公司）；石蠟切片機（德國Leica公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理圖像分析儀（武漢同濟醫科大學千屏影像工程公司）；ALP測定試劑盒（BGH Bio Co，臺灣）西安地區健康雄性成年雜種犬15只，體質量12.714.6 kg 1.2方法 1.2.1動物分組將雜種犬隨機等分為3組：A組為肌瓣包裹組

9、；B組為肌瓣復合BMP/I型膠原復合物組；C組為空白對照組均術前晚禁食 1.2.2制備rhBMP2膠原緩釋系統取320 mg膠原凍干品，溶于適量10 mmol/L鹽酸溶液，pH值調至5，成黏稠液體rhBMP2干粉32 mg溶于適量滅菌水，充分攪拌混勻入膠原溶液中均分成8份，凍干，呈白色海綿狀環氧乙烷消毒，4下密封保存每份含rhBMP2 1 mg，膠原10 mg 1.2.3麻醉及手術速眠新（0.15 mL/kg，im）麻醉仰臥位固定，氣管插管行機械通氣術野備皮，常規消毒、鋪單在環狀軟骨與胸骨間沿頸正中線作一切口，長約15 cm分離并顯露頸段氣管切取一5環氣管段，青霉素生理鹽水溶液沖洗，測量管腔橫

10、徑(a1)及前后徑(b1)2 ，A組：雙側胸骨舌骨肌胸骨甲狀肌聯合肌瓣包裹移植段及上下吻合口B組：同A組肌瓣包裹，每個環間植入BMP/I型膠原溶液1 mLC組：原位再植30無損傷縫線對端全層褥式外翻吻合氣管，逐層縫合頸部切口 1.2.4rhBMP2膠原緩釋系統植入方法取上述復合物凍干品1份，4 mL滅菌注射用水溶解，呈透明較黏稠液體吸入5 mL注射器，多點環形分別注射入B組各軟骨環間隙內1 mL即各環間分別植入rhBMP2 1 mg，膠原10 mg 1.2.5術后處理及取材時間所有動物均于術畢立即肌注青霉素8×105 u，相同條件喂養1，2，4，8及10 wk分別處死各組動物1只取移

11、植段氣管，常規石蠟包埋、切片（厚度5 m） 1.2.6觀察指標動物存活情況；大體結構變化；組織學變化，HE染色、Massons三色法染色；定量組織學測定軟骨環間rhBMP2膠原緩釋系統植入區及其兩側的新生軟骨區；移植段通暢度：參考Nakanishi等2方法計算；軟骨積分：半定量測定軟骨細胞的存活情況 ，根據公式3IS (intensity score)=0×F0 1×F1 2×F2 3×F3，F =%×10視野，計算每張切片的染色強度平均值；新生微血管密度（MVD）：按Weidner4報道的方法進行計數，取其平均值，換算血管數量，計算平均染色強

12、度；使用ALP測定試劑盒，測量各軟骨環間區域，顯示ALP的分布 統計學處理：數據用x±s表示，采用SPSS統計軟件包處理，組間比較采用方差分析及SNKq檢驗；組間方差不齊時用非參數秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義. 2結果 2.1動物存活情況B組：全部存活至預殺期A組：術后5 d因腹瀉死亡1只，其余全部存活至預殺期C組：分別死于術后3，19和27 dA，B組動物，普遍術后12 wk內僅有呼吸道刺激表現，34 wk開始出現呼吸困難4 wk以后，呼吸困難逐漸減輕    2.2大體結構變化A組：移植體軟骨有輕度破壞伴部分吸收，管腔略狹

13、窄；B組：移植段與肌瓣粘連緊密；黏膜充血，吻合口愈合良好，氣管環大體形態保持良好C組：移植段氣管軟化成膜狀，偶見增厚；管腔縮窄，腔內明顯肉芽增生；軟骨環部分斷裂、破壞或消失.    2.3組織學改變A組：氣管形態保持尚好, 但均伴不同程度的軟骨細胞變性、壞死，可見少量新生軟骨細胞(Fig 1)B組：肌瓣兩側rhBMP2植入區可見較多新生軟骨細胞(Fig 2)，細胞外軟骨基質較豐富, 軟骨環間隙為纖維血管組織占據C組：可見黏膜脫落，軟骨壞死溶解吸收及大量肉芽組織增生個別切片軟骨膜外側偶見新生軟骨細胞(Fig 3) 2.4通暢度、軟骨積分各組間比較有顯著差異

14、（P<0.05）. A，B組通暢度高且軟骨保持好；B組軟骨保持效果最好(Tab 1).表13組移植段氣管的比較（略） 2.5MVD定量組織學各組整體有顯著性差異（P<0.01）A，B及B，C組間ALP含量在術后2，4 wk有顯著性差異(P<0.05, Tab 2). 肌瓣包裹移植段可以促進血管再生，局部應用BMP可提高軟骨細胞ALP含量(Tab 1).表2犬氣管軟骨堿性磷酸酶染色陽性區域比例表（略） 2.6新生軟骨面積定量組織學測定各組間比較有顯著性差異（P<0.05）. B組新生軟骨量最多，C組新生軟骨最少(Tab 3).表3新生軟骨面積比較（略） 3討論 軟骨軟化吸

15、收是氣管移植實驗研究的難點我們前期研究表明：帶蒂大網膜包裹移植段，可促進血供重建；BMP/I型膠原復合物可誘導軟骨生成延緩吸收5；肌瓣包裹可促進血供重建6我們證明：肌瓣在包裹移植體基礎上，植入BMP/I型膠原復合物，軟骨再生量有明顯增加，能較好的維持氣管環的大體形態 MVD是衡量血管生成的定量指標，B、C組肌瓣包裹的觀察區呈現明顯陽性染色的棕黃色，證實了肌瓣包裹可有效促進血供重建ALP的活性是成骨細胞分化的過程中非常敏感的指標7B組動物26 wk氣管軟骨ALP維持高含量，8 wk后逐漸降低，提示BMP/I型膠原緩釋系統釋放BMP結束于8 wk前，釋放的持續時間較長，可能與復合物注射在軟骨環間，

16、周圍結締組織較致密，BMP在組織間擴散受影響有關. 實驗中B組能較好地促進軟骨的再生，較A組再生量明顯增加，但與BMP誘導的典型的軟骨化骨過程不同，我們并未發現新生軟骨能進一步骨化，可能與例數、觀察時間，成骨微環境等有關8A組新生血管略顯不足，有移植段狹窄的現象可能因創傷、血管密度低、瘢痕增生、局部的微環境差等9，影響了彈性支架的形成而B組更利于血供重建及軟骨形態維持；肌瓣包裹移植段，能誘導出新生血管，BMP則可抑制軟骨吸收，提高ALP表達，形成生物彈性支架，動物可存活8 wk以上 自體移植，可除外免疫排斥影響；肌瓣包裹，可誘導出較多新生血管移植段血供豐富，形態較完整，通暢度高，B組軟骨結構保

17、持較好，軟化現象明顯輕于其他組而A組通暢度尚可，但固有軟骨結構較B組差，維持氣管結構的遠期效果也差；C組多在術后短期死亡，活過2 wk的2只犬移植段也變性壞死，管腔塌陷，被纖維結締組織代替. 可見,肌瓣包裹既利于血管的再生，又利于保持固有軟骨結構，維持氣管通暢度輔以BMP/I型膠原緩釋系統，為BMP提供靶細胞間充質細胞，可達良好的生物固定，形成彈性支架，克服軟化狹窄性氣管塌陷10可為新生血管生長提供時間，為修復氣管缺損提供實驗基礎 【參考文獻】 1 李小飛，程慶書，劉錕，等.自體氣管移植軟骨再生的研究J.中華實驗外科雜志，2003;9:833-834. Li XF, Cheng QS, Liu

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