1、毒熱平注射液抗流感病毒肺損傷機制的研究(一)    作者：張艷麗， 范新生， 李澎濤，【摘要】 目的 研究毒熱平注射液對流感病毒感染小鼠肺損傷的治療機制。方法 用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎的生物模型，用不同濃度毒熱平注射液治療后，觀察流感病毒感染小鼠肺臟病理變化;Griess法檢測肺勻漿NO含量;ELISA方法測定肺勻漿中IL-1和TNF-的水平。結(jié)果 毒熱平注射液各劑量組均能明顯減輕肺臟病變;顯著降低肺勻漿NO含量(P0.001);各劑量組小鼠肺勻漿的IL-1 和TNF-含量顯著下降。結(jié)論 毒

2、熱平注射液可通過降低流感病毒感染小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)而發(fā)揮保護作用。 【關(guān)鍵詞】 毒熱平;流感病毒;肺損傷;NO全球每年肺炎患者的死亡率超過其它感染性疾病1-2，呼吸系統(tǒng)是流感病毒侵襲的靶系統(tǒng)，“溫邪上受，首先犯肺”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為流感的病機主要是“毒損肺絡(luò)”，為感染性肺損傷，是流感病毒的致炎與機體的抗炎反應(yīng)過程。毒熱平注射液是根據(jù)長期臨床實踐基礎(chǔ)上形成的中醫(yī)理論-“毒損肺絡(luò)”的病機理論，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)下呼吸道感染性疾病的病理過程及治療的研究成果，配伍研制而成，具有清熱解毒的功效。本實驗旨在探討毒熱平注射液對流感病毒感染小鼠肺損傷的治療效果及作用機制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 病毒

3、 流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FM1)，中國中醫(yī)藥研究院中醫(yī)所提供，本實驗室-76保存?zhèn)溆谩Ｓ? 日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代兩次后，測血凝滴度為1512。1.1.2 動物 ICR小鼠，體重(14±1)，合格證號：SLXK(京2005-2006)，級別：SPF/VAF。小鼠及飼料均由北京維通利華實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：本室動物室動物潔凈柜，室溫(22±2)，相對濕度(50±10)%。1.1.3 藥物 毒熱平注射液，由黃芩、梔子、燈盞花和豬膽粉四味藥物制成的中藥復(fù)方注射劑，棕色液體，含提取物17.4 g·L-1，由廣東康美藥業(yè)有限公司開發(fā)提供;陽性對照藥：注射用雙

4、黃連(凍干粉)：0.6 g干粉/支，實驗前用無血清DMEM培養(yǎng)液配制成40 g·L-1備用，批號：0501004(哈藥集團中藥二廠);利巴韋林：0.1 g·mL-1，批號：0506251(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司)。1.1.4 試劑 細(xì)胞因子檢測試劑盒購自美國Biosource公司。Griess 試劑：A 液為0.1%萘替乙二胺。B 液為5%的磷酸加1%的磺胺。避光4保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r，A液和B液11混勻即可。乙醚、生理鹽水、75%酒精、組織病理切片HE染色材料由本室提供。1.2 方法31.2.1 流感病毒對小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定3取ICR小鼠50只，用單純隨機抽樣

5、法隨機平均分成5組，病毒為2-62-10 5個稀釋度，參照文獻3方法計算病毒的半數(shù)致死量(LD50)。1.2.2 對流感病毒所致小鼠肺損傷的保護作用 取ICR小鼠70只，隨機分組、給藥見表1，造模方法見文獻3。無菌摘取肺臟(每組取5只)，肉眼觀察各組肺組織外觀，用10%福爾馬林液固定10d以上后制備組織切片行HE染色，顯微鏡觀察照相。表1 動物分組和給藥劑量1.2.3 流感病毒感染小鼠肺勻漿細(xì)胞因子和NO的檢測 取上述各組另5只鼠的肺臟，按參考文獻3的方法制備肺勻漿。用雙抗體夾心ABC-ELISA 法檢測肺勻漿上清中IL-1和TNF-含量，程序按照試劑盒說明書進行。同時取上述各組肺勻漿上清，加

6、入96孔板中，100 L/孔，再加入等量的Griess液，室溫放置10 min，于酶標(biāo)儀530 nm下測NO的 A值。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用SPSS處理，計量資料的組間顯著性比較用t檢驗。P0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 流感病毒感染小鼠的LD50按Reed-Munch 公式計算出病毒的半數(shù)致死量(LD50)為10-2.2。2.2 小鼠肺臟大體病變正常對照組小鼠肺臟呈淡粉紅色，含氣，無實變區(qū)。病毒感染模型組可見感染小鼠肺臟體積增大，大多數(shù)均有2個肺葉以上成片的實變區(qū)，呈現(xiàn)暗紅色外觀，而各治療組肺部病變均有不同程度的減輕。2.3 病理形態(tài)觀察光鏡下觀察正常組小鼠肺泡、肺泡囊、肺

7、泡管、肺泡隔形態(tài)完整，肺泡大小較一致，肺泡壁厚度正常，支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無分泌物，胞漿呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，外周未見炎細(xì)胞浸潤(圖1-A，見插頁2)。模型組呈現(xiàn)重度間質(zhì)性肺炎病變，小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、細(xì)支氣管等正常的組織結(jié)構(gòu)消失，結(jié)締組織增生，大量淋巴細(xì)胞浸潤，形成實變區(qū)，組織間見大量紅細(xì)胞，血管內(nèi)充血(圖1-B，見插頁2)。毒熱平各劑量組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡隔較正常組稍有增厚，偶見少量的淋巴細(xì)胞浸潤(圖1-C，見插頁2)。2.4 小鼠肺勻漿NO及IL-1、TNF-含量測定各組小鼠肺勻漿NO及IL-1和TNF-的含量變化見表2。表2 毒熱平注射液對流感病毒感染小鼠肺勻

8、漿NO和IL-1、TNF-的影響以上結(jié)果顯示，毒熱平注射液各劑量組均可明顯降低流感病毒感染小鼠肺組織中NO及IL-1和TNF-的含量。3 討論在肺部免疫系統(tǒng)中，肺巨噬細(xì)胞占有重要地位。當(dāng)組織損傷或嚴(yán)重感染后，巨噬細(xì)胞募集到周圍損傷組織并被激活，釋放大量的前炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-、趨化性細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子及NO等，這些細(xì)胞因子在肺組織炎性損傷的發(fā)生中均有重要作用。其中TNF-等細(xì)胞因子是最早釋放的介質(zhì)，TNF-激活損傷粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等，進一步釋放氧自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物、溶酶體酶等介質(zhì)形成逐級放大的瀑布樣鏈鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)組織細(xì)胞損害。TNF-激活單核-巨噬細(xì)胞，增強

9、其吞噬能力，促使呼吸爆發(fā)和氧自由基釋放，促使脫顆粒及溶酶體酶釋放，增加脂質(zhì)代謝產(chǎn)物生成，介導(dǎo)細(xì)胞和組織的損害;同時，單核-巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生TNF-的主要細(xì)胞，它釋放的TNF-，能進一步刺激單核細(xì)胞合成和釋放TNF-、IL-1、血小板源性生長因子(PDGF)等單核因子，使TNF-毒性作用放大，可加重局部的炎癥反應(yīng)4。TNF-對肺臟具有強烈的毒性，它能誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞脫顆粒和毛細(xì)血管滲漏等，從而誘發(fā)并進一步加重炎癥反應(yīng)。有資料顯示IL-1、TNF-的含量變化與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，升高越明顯，病情越危重5，本實驗發(fā)現(xiàn)，病毒對照組小鼠肺勻漿中IL-1、TNF-含量較正常組升高。毒熱平

10、注射液治療組能明顯降低IL-1、TNF-的含量，說明此藥能明顯減少流感病毒所致小鼠肺組織炎性因子過量產(chǎn)生與釋放，減輕其對肺臟的病理損害，對流感引起的肺炎具有治療作用。另外，巨噬細(xì)胞還分泌某些非肽類的小分子活性因子，如NO。大量研究表明，NO作為活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞毒效應(yīng)分子，能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抑制和殺傷多種病原微生物。NO對細(xì)菌和原蟲明確的抗菌作用已得到公認(rèn)，但在呼吸道病毒感染如甲型流感病毒引起的肺炎中卻有相反的作用，它會加重肺部病理損傷6，抑制NO的產(chǎn)生可明顯減輕流感病毒引起的病毒性肺炎病理反應(yīng)。本實驗中模型組小鼠肺組織NO含量較正常組升高，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義，這表明急性肺炎時NO水平

11、的升高，也是造成肺組織損傷的一個重要因素。毒熱平注射液治療組肺勻漿中NO含量較模型組顯著降低，表明該藥可通過降低肺組織中NO的含量來減輕肺組織中NO代謝產(chǎn)物的毒害作用，對肺組織具有保護作用，這與前面的肺臟病理切片結(jié)果基本一致。本研究證實毒熱平注射液可通過調(diào)節(jié)肺組織局部炎癥因子的表達(dá)減輕流感病毒感染小鼠的肺損傷，從而發(fā)揮保護作用。【參考文獻】1 Joos L，Tamm M.Breakdown of pulmonary host defense in the immunocompromised host：cancer chemotherapyJ.Proc Am Thorac Soc，2005，2：

12、445-448.2 Rothberg MB，Haessler SD，Brown RB.Complications of viral influenzaJ.Am J Med，2008，121：258-264.3 張艷麗，顧立剛，范新生.毒熱平注射液抗流感病毒感染小鼠的保護作用J.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，30(2)：150-151.4 Millar AB，F(xiàn)oley NM，et al.Tumour necrosis factor in bronchopulmonary secretions of patients with adult respiratory distress syndromeJ.Lancet，1989，2(8665)：712-714.5 Aldridge JR，Jr，Moselev CE，Negovetich NJ，et al.TNF/iNOS-