1、枸櫞酸鉀對大鼠腎草酸鈣結石骨橋蛋白表達的影響         11-03-15 09:58:00     編輯：studa20                  作者：才春東， 姜寧，王國增，鄭景存【摘要】  目的 探討枸櫞酸鉀對大鼠腎草酸鈣結石骨橋蛋白（osteopontn，OPN）表達的影響。方

2、法 32只8周齡雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、枸櫞酸鉀組、結石組(乙二醇和氯化氨)、結石+枸櫞酸鉀組，每組8只，采用乙二醇和氯化銨誘導大鼠腎草酸鈣結石模型進行試驗研究。連續給藥4周后處死大鼠取腎組織，采用HE染色和免疫組化法檢測各組腎結石形成及OPN表達情況。結果 結石+枸櫞酸鉀組大鼠腎結石形成比結石組明顯減少(P0.05)；結石+枸櫞酸鉀組大鼠的OPN表達比結石組明顯降低(P0.05)；枸櫞酸鉀組OPN表達與對照組相比無明顯變化( P0.05)。結論 枸櫞酸鉀可能通過減少草酸鈣結晶的形成而減輕對腎小管上皮細胞的損傷，降低腎OPN的表達。 【關鍵詞】  枸櫞酸鉀；骨橋蛋白；

3、腎結石Abstract: Objective  To examine the effect of citrate on osteopontin(OPN) expression of urinary oxalate calcium (CaOx) stone formation in rats.Methods  thirty-two adult male wistar strain rats were randomly divided into four groups (n=8 each): normal control group、the citrate group、ston

4、e formation group（ethylene glycol(EG)and ammonium chloride）and the stone formation-citrate group.After 4 weeks medication,the rats were killed and  kedney was used for histological examination.The formation of renal stone and the expression of OPN in rat renal tissue of each group were determin

5、ed with HE staining and Immunohistochemistry methods.Results  The formation of renal stone in the stone formation-citrate group was significantly lower than that in the stone group.The expression of OPN in the stone formation-citrate group was significantly less than that in  the stone gro

6、up.However those in the contol group and in cirate group showed the same.Conclusion  Citrate can reduce crystal formation and crystal damaging on renal duct and decrease OPN expression.Key words:citrate; OPN; CaOx stone泌尿系結石是泌尿外科常見的疾病。雖然泌尿系結石的治療技術不斷提高，治療策略不斷完善，但其復發率卻無明顯降低1。既往研究表明，枸櫞酸鉀對結石的預防起重要的

7、作用，尤其對草酸鈣結石的發生或形成具有抑制作用2。目前，枸櫞酸鉀對骨橋蛋白（osteopontn，OPN）表達的影響尚不完全清楚。本文通過枸櫞酸鉀對OPN表達的研究，希望能夠為預防結石的產生提供新的依據。1  材料和方法1.1  材料 8周齡健康雄性Wistar大鼠32只，體重180220g，由上海第二軍醫大學動物實驗中心提供。乙二醇、枸櫞酸鉀和氯化氨購于上海長城華美儀器化劑公司。兔抗OPN的多克隆抗體購于北京博奧森生物科技有限公司，二步法免疫組化試劑盒購于上海長島生物科技有限公司。1.2  動物處理 以1%乙二醇和1%氯化氨混合溶液為致石劑。

8、大鼠飼養1周，充分適應環境后，隨機分成4組，每組8只。正常對照組以純凈水2mL灌胃，枸椽酸鉀組以25%枸椽酸鉀溶液1mL·100g-1灌胃，結石組以致石劑2mL灌胃，結石+枸椽酸鉀組以致石劑2mL灌胃同時用25%枸椽酸鉀溶液1mL· 100g-1灌胃。各組動物每日灌胃1次，連續4周。實驗結束后，取左側腎臟，用10%甲醛固定，在腎臟中段橫取2mm厚的組織塊，進行梯度乙醇脫水、用二甲苯透明、浸蠟、包埋，Leitz1512切片機作連續切片4張,厚度為5m。1.3  常規HE染色 切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。入蘇木素染液5min，1%鹽酸乙醇溶液分化5s，自

9、來水藍化30min，1%伊紅染液1min，各級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。1.4  免疫組化 對大鼠腎組織的石蠟切片，厚度5m，行免疫組化染色： 切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2室溫孵育消除內源性過氧化物酶的活性； 磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，0.01mol·L-1檸檬酸緩沖液做抗原修復； 滴加兔抗OPN多克隆抗體（1200稀釋，每次實驗均設2張陰性對照,以PBS代替一抗)，4過夜； PBS沖洗，滴加二抗，室溫30min； PBS沖冼，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。1.5  顯微鏡觀察 用Olympus光學顯微

10、鏡(×400)觀察各組別的常規HE切片及免疫組化切片。HE切片 “-”表示無結石及結晶沉淀物;“+”表示少量結晶沉淀物;“+”表示有結晶沉淀物，有時可見游離結石形成;“+”表示有大量的結晶，并有游離結石形成。免疫組化切片按“+”表示腎小管胞漿輕度染色(淺黃色);“+”表示腎小管胞漿中度染色(黃色);“+”表示腎小管胞漿明顯染色(深棕黃色)。隨機選取5個視野進行分級并統計分析。1.6  統計學方法數據采用SPSS 13.0統計軟件，采用Kruskal-Walls非參數檢驗對4組大鼠腎臟成石程度和OPN表達強度進行統計分析，采用Mann-whitney非參數檢驗進行組間兩兩比較

11、。2  結果2.1  大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體形成情況    草酸鈣結晶在常規病理切片為無色透明晶體。本實驗中對照組和枸櫞酸鉀組大鼠腎小管未見擴張和草酸鈣晶體沉積（如圖1A、B，見封2）；結石組大鼠部分腎組織腫脹，表面點狀分布黃白色結晶或鈣化，鏡下見多數管腔內存在彌漫散布無色透明，大多呈連續片狀結晶,皮質多于髓質,結晶體主要位于近曲小管和遠曲小管，上皮細胞明顯腫脹、變性、壞死，管腔內可見嗜伊紅樣染色壞死物質及部分脫落上皮細胞，且腎間質有炎性細胞浸潤（如圖1C，見封2）；枸櫞酸鉀+結石組腎小管腔僅見較少散在草酸鈣結晶存在，管腔擴張程度較輕（如圖1D，見封2）。大鼠腎臟成石程度分級結果詳見表1。表1  各組大鼠腎臟成石程度分級（略）2.2  免疫組化結果    OPN在所有4組中均有表達，在腎近曲小管和遠曲小管、亨利氏袢和集合管(主要髓袢升支)均明顯表達，而在皮質腎小球中則未見表達。對照組OPN微弱表達（圖2A，見封2）；枸櫞酸鉀組OPN呈微弱表達（圖2B，見封2）；結石組大鼠腎組織中OPN表達增強（圖2C，見封2）；結石+枸櫞酸鉀組腎組織OPN的表達（圖2D，見封2）強于對照組，較結石組弱。大鼠腎臟骨橋蛋白程度分級結果詳見表2。表2  各組大鼠腎臟骨橋