1、不同植物不同植物SOD提取及活力測定提取及活力測定1、SOD簡介簡介超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD是一種廣泛存是一種廣泛存在于動、植物和微生物中的金屬蛋白酶，在于動、植物和微生物中的金屬蛋白酶，是一種重要的抗氧化劑，可清除自由基，是一種重要的抗氧化劑，可清除自由基，其清除自由基的反應如下：其清除自由基的反應如下： 生物體在長期的生命活動中，常常會因生物體在長期的生命活動中，常常會因為環境因素或生理條件的變化而出現氧為環境因素或生理條件的變化而出現氧自由基增加、抗氧化能力降低的情況，自由基增加、抗氧化能力降低的情況，并由此引發一系列疾病。如脂質的過氧并由此引發一系列疾病。如脂質的過氧化與膜疾

2、病、腫瘤、衰老、心血管疾病、化與膜疾病、腫瘤、衰老、心血管疾病、創傷、輻射損傷、高度中毒等。創傷、輻射損傷、高度中毒等。O2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2SOD不同植物不同植物SOD提取及活力測定提取及活力測定 SOD由于可以清除氧自由基，因此可以防止這些疾由于可以清除氧自由基，因此可以防止這些疾病的產生。而且，病的產生。而且，SOD還可作為一種添加劑，添加還可作為一種添加劑，添加到化妝品和食品中，在預防和治療由于自由基增多到化妝品和食品中，在預防和治療由于自由基增多而引起的一系列疾病和延緩衰老方面起到一定作用。而引起的一系列疾病和延緩衰老方面起到一定作用。 2、活性測定原理、活性

3、測定原理 SOD活性測定的方法很多，常見的有化學法，免疫活性測定的方法很多，常見的有化學法，免疫法和等電聚焦三種，其中以化學法應用最普遍。法和等電聚焦三種，其中以化學法應用最普遍。不同植物不同植物SOD提取及活力測定提取及活力測定 本試驗即采用化學法來測定本試驗即采用化學法來測定SOD的活性，使用的試的活性，使用的試劑為氮藍四唑劑為氮藍四唑NBT），），NBT在光照下能與在光照下能與O2發發生光化還原反應生成藍色甲潛生光化還原反應生成藍色甲潛qian），該化合物），該化合物在在560nm處具特征光吸收，而處具特征光吸收，而SOD能抑制能抑制NBT的光的光化還原，有關的化學反應式如下：化還原，有

4、關的化學反應式如下： 不同植物不同植物SOD提取及活力測定提取及活力測定 核黃素，核黃素，TEMEDO2 O2光照光照還原劑還原劑NBT + O2 甲甲qian）藍色，藍色，560nm處具特征光吸收，處具特征光吸收，OD值與值與 O2 含量成正比。含量成正比。光照光照SOD光照光照NBT + O2 抑制反應抑制反應抑制原因：抑制原因：SODO2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2 SOD對對NBT光化還原的抑制程度與光化還原的抑制程度與SOD活性成正比，活性成正比，故可通過比色法測出故可通過比色法測出SOD的抑制率，以抑制光化還原反的抑制率，以抑制光化還原反應的應的50%為一個活力單位，

5、即可計算出為一個活力單位，即可計算出SOD的活力。的活力。不同植物不同植物SOD提取及活力測定提取及活力測定3、試驗步驟、試驗步驟各步試驗步驟及注意事項解說祥見各步試驗步驟及注意事項解說祥見p118。4、實驗結果及處理、實驗結果及處理SOD活性計算公式：活性計算公式：OD對照對照-OD測試測試OD對照對照10050 稀釋倍數稀釋倍數 WSOD活性活性u/g鮮重）鮮重）=（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色1、SOD同工酶簡介同工酶簡介在高等生物的組織和器官中普遍存在著在高等生物的組織和器官中普遍存在著SOD同工酶，按其結合的金屬離子的不同工酶，按其結合的金屬離子的不同可分為：同可分為：F

6、e-SOD，Mn-SOD，Cu、Zn-SOD三種，這三種酶均能催化氧自由三種，這三種酶均能催化氧自由基的清除反應。基的清除反應。Fe-SOD，Mn-SOD在蛋白質一級結構、在蛋白質一級結構、空間結構、分子量、光譜性質及對不同空間結構、分子量、光譜性質及對不同抑制劑的敏感性等方面與抑制劑的敏感性等方面與Cu、Zn-SOD差差別較大。別較大。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 Mn-SOD在真核生物中多為四聚體，在原核生物中在真核生物中多為四聚體，在原核生物中為二聚體。為二聚體。 Fe-SOD大多數為二聚體。大多數為二聚體。 這兩種這兩種SOD的許多性質都很相似，如兩種酶的一級的許多性質都

7、很相似，如兩種酶的一級結構和空間結構均很相似，每個亞基的分子量一般結構和空間結構均很相似，每個亞基的分子量一般均為均為23000D，并含有，并含有0510個個Mn或或Fe原子。不原子。不同來源的同來源的Fe-SOD和和Mn-SOD其一級結構的同源性均其一級結構的同源性均很高。很高。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 Cu、Zn-SOD則一般是由兩個相同的亞基組成的二則一般是由兩個相同的亞基組成的二聚體，每個亞基的分子量約為聚體，每個亞基的分子量約為16000D，含一個銅原，含一個銅原子及一個鋅原子，不同來源的子及一個鋅原子，不同來源的Cu、Zn-SOD其一級其一級結構的同源性也很高。結

8、構的同源性也很高。 2、SOD同工酶活性染色原理同工酶活性染色原理 由于三種由于三種SOD同工酶的分子量和電荷間存在差異，同工酶的分子量和電荷間存在差異，因此可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法將三種因此可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法將三種SOD同工同工酶分開。酶分開。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 電泳完后，根據電泳完后，根據SOD活性測定原理，將活性測定原理，將NBT溶液加溶液加入凝膠，在光照下，凝膠中不含入凝膠，在光照下，凝膠中不含SOD的地方，由于的地方，由于NBT進行光化還原生成藍色甲潛，因此凝膠呈藍色；進行光化還原生成藍色甲潛，因此凝膠呈藍色； 而在而在SOD同工酶譜帶處，由于同工酶譜帶處，由于SOD抑制抑制NBT的光化的光化還原，無藍色甲潛的生成，因此凝膠透明，即藍色還原，無藍色甲潛的生成，因此凝膠透明，即藍色背景下的透明帶即為背景下的透明帶即為SOD同工酶譜帶。通過這種方同工酶譜帶。通過這種方法，可觀察到不同來源法，可觀察到不同來源SOD同工酶之間以及同一來同工酶之間以及同一來源不同發育階段之間源不同發育階段之間SOD同工酶的差異。同工酶的差異。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色3、材料與試劑、材料與試劑 試驗材料：新鮮植物葉片。試驗材料：新鮮植物葉片。 試驗試劑：詳見試驗試劑：詳見P117。4、操作方法、操作方法