1、紫杉醇固體脂質納米粒的制備及質量評價李智，韓靜，岑琴，潘岳峰，殷莉梅（沈陽藥科大學制藥工程學院，遼寧 沈陽110016）摘要: 目的 利用超聲分散法制備紫杉醇固體脂質納米粒，并考察其穩定性。方法 以穩定性、zeta電位、粒徑、包封率為考察指標篩選制備工藝，對超聲時間、超聲功率、脂質材料和乳化劑的用量做了詳細的考察。結果 通過單因素及正交實驗確定最佳處方為:脂質骨架單硬脂酸甘油酯（100/150mg）、乳化劑豆磷脂100mg、助乳化劑Pluronic F68:Tween 802:1,在75±5下乳化，之后以功率300W進行超聲，時間為20min。結論 本實驗成功地將紫杉醇裝載進固體脂質

2、納米粒中，納米粒在膠體分散液中分散均勻，穩定性良好。此制備工藝安全、可靠，有很大的發展前景。關鍵詞：紫杉醇；固體脂質納米粒；粒徑；包封率中圖分類號： R944.4 文獻標識碼： A 文章編號：Preparation and quality evaluation of paclitaxel loaded solid lipid nanoparticles LI Zhi, HAN Jing, CEN Qin, PAN Yue-feng, YIN Li-mei（School of Pharmaceutical Engineering, Shenyang Pharmaceutical Universi

3、ty, Shenyang 110016, China）ABSTRACT: OBJECTIVE The paclitaxel loaded solid lipid nanoparticles were prepared by an ultrasonic-solvent emulsification technique. The stability of SLNs was investigated in this study. METHOD The technology was preferenced by stability, zeta potential, particle diameter

4、and entrapment efficiency as indicatrix. The dosises of lipid materials and coemulsifier, transonic time and transonic power were investigated in detail. RESULTS The best prescriptions were definited by one-factor and orthogonal design. The adjuvant: glyceryl monostearate (100/150mg), Fabaceous Leci

5、thin, coemulsifier Pluronic F68:Tween 802:1. The samples were sonicated with an energy output of 300W in 20 min after emulsified at 75±5. CONCLUSION The paclitaxel loaded SLNs were successful prepared, and SLNs which have high stability were aequalis dispersed in colloidal solution. This techno

6、logy which was safety and reliability has nice outlook.Key words: Paclitaxel; Solid lipid nanoparticles (SLNs); Particle diameter; Entrapment efficiency 紫杉醇(paclitaxel，PTX)是得自短葉紫杉樹皮的獨特二萜類抗癌化合物。美國FDA于1992年批準紫杉醇注射液上市，先后批準其用于治療卵巢癌、乳腺癌及非小細胞肺癌。由于紫杉醇難溶于水（溶解度小于1mg/mL），在臨床中需將紫杉醇溶于無水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）的

7、混合溶液中。但聚氧乙烯蓖麻油會影響人體內皮和脈管組織的功能，并會引起血管擴張、呼吸困難、昏厥、低血壓等負作用1。為了使藥物更好的應用于癌癥患者，本研究將藥物裝載進固體脂質納米粒中，避免了由于聚氧乙烯蓖麻油帶來的毒副作用。固體脂質納米粒（SLN）是由可生物降解的脂質材料構成的藥物傳遞載體，它不但可以促進藥物吸收，減少藥物毒性，而且還有控釋、靶向的功能2,3。國家“十一五”計劃明確指出要大力發展“高靶向緩釋納米醫藥制劑的研發”，所以此項目有很大發展前途和應用前景。本研究采用熔融超聲分散法制備紫杉醇固體脂質納米粒（PTX-SLN），以穩定性、zeta電位、粒徑、包封率為考察指標篩選制備工藝，優化處方

8、，并對最優處方進行質量評價。1 儀器與試藥1.1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；高效液相色譜儀（日本日立公司）；DF-101恒溫磁力攪拌（鞏義英峪予華儀器廠）；JY82-D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Hitachi低溫超速離心機（日本Kaki Co.）；Nicomp380/ZLS激光散射粒度分析儀（美國PSS公司）；802離心沉淀機（姜堰市新康醫療器械有限公司）1.2 試藥 紫杉醇（上海三維制藥有限公司）；葡聚糖凝膠 G-25（浙江黃巖四青升華材料廠）；單硬脂酸甘油脂、硬脂酸（天津市博迪化工有限公司）；大豆磷脂（江蘇曼氏生物科技有

9、限公司）2 方法2.1 色譜條件及標準曲線的繪制色譜柱：Diamonsi1TM C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5m，迪馬公司)；流動相：甲醇：乙腈：水(2：9：10)；柱溫：30；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測波長：227nm；進樣量：20L。 精密稱取紫杉醇對照品5mg, 用甲醇溶解配制成濃度為1mg·mL -1的對照品溶液。分別量取紫杉醇對照品儲備液0.05,0.1,0.2,0.4,0.8mL置5個10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,0.45m 濾膜過濾,量取20L ,注入色譜儀,紀錄色譜峰面積，以峰面積(A)與對照品濃度(C)進行

10、線形回歸，得到回歸方程。2.2 準確度（加樣回收率）、精密度試驗（日內、日間精密度） 按照相同處方制備高、中、低三種不同濃度的紫杉醇固體脂質納米粒膠體溶液，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，取20L進樣，記錄峰面積A1；將樣品溶液破乳后分別精密加入一定量紫杉醇對照品（1：1）,記錄樣品峰的面積A2，以A1A2計算加樣回收率。精密量取濃度為5,10,20,40,80g·mL-1的紫杉醇對照品溶液,每個樣品1d及7d內各重復進樣6 次,進樣量均為20L ,進行色譜分析,依法測定其含量，計算日內、日間精密度。2.3 樣品包封率及載藥量的測定 將Sephadex G-25用30乙醇浸泡24h

11、，裝于1cm×20cm色譜柱中，凝膠層高10cm，用蒸餾水洗脫至無乙醇殘留，備用。精密量取0.5ml載藥納米膠體溶液，上樣于Sephadex G-25，用蒸餾水洗脫，出現藍色乳光后開始收集，10ml后藍色乳光消失停止收集，取出2ml加甲醇超聲破乳，以破乳后含量占總量的百分比為包封率，見公式1。以SLN中紫杉醇的含量占SLN總質量的百分比為載藥量，見公式2。包封率（%）=Wsample/Wtotal×100% Eq.1Wsample：測得SLN中紫杉醇的含量；Wtotal：處方中紫杉醇的總含量載藥量（）Wsample /WSLN×100% Eq.2Wsample：測

12、得SLN中紫杉醇的含量；WSLN：SLN的總質量2.4 穩定性考察首先觀察納米粒膠體分散系中是否有分層或沉淀現象，如沒有此類現象，取分散系適量，置于一干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下油鏡觀察（10×100倍）是否有微粒出現，若沒有表明穩定性良好，如果由微粒出現記錄穩定天數（d）作為考察指標。2.5 制備工藝稱取處方量的脂質載體材料（單硬脂酸甘油脂、硬脂酸、膽固醇），(75±2)加熱熔融后與紫杉醇混合均勻，作為油相。助乳化劑（Pluronic F68、Tween 80）加入到10ml蒸餾水中溶解，再將乳化劑豆磷脂加入水中，磁力攪拌分散后加熱至(75±2)作為水相

13、。磁力攪拌下將水相趁熱滴加入同溫度油相中，制得乳化劑，超聲分散，即得固體脂質納米粒。2.6 最佳處方的質量評價（光穩定性、滅菌、冷凍）分別量取最佳處方的紫杉醇納米粒分散液8 mL，加入到6個安瓿瓶中，全部密封。暴露于室內日光燈下72h，同時以避光樣品作對照，考察樣品光穩定性；采用100 流通蒸汽滅菌30 min，考察樣品滅菌穩定性；將安瓿瓶放入冰箱的冷凍室內，冷凍樣品，24h后全部取出，待樣品解凍后，考察其冷凍穩定性。以上結果均以包封率、粒徑、zeta電位為指標進行考察。3 結果3.1 線形范圍及準確度、精密度實驗對照品溶液在5g·mL-180g·mL-1范圍內濃度(C)

14、與峰面積(A) 呈良好的線性關系：A = 4E+07C + 127794(R2=0.9999)。高、中、低三種濃度的紫杉醇固體脂質納米粒膠體溶液加樣回收率在98.6%101.8%范圍內，RSD<1.7%。對照品溶液精密度計算結果為日內精密度RSD<2.0% 和日間精密度RSD<4.0%。3.2 超聲時間和超聲功率的考察一般來說，超聲時間越長，納米粒粒徑越小，納米膠體分散系分散得越均勻，但超聲時間過長，超聲探頭會釋放更多鈦顆粒雜質，造成納米粒污染。以包封率及穩定性為考察指標，對超聲時間及超聲功率進行單因素考察，結果見圖1。圖 1 超聲時間及功率對紫杉醇固體脂質納米粒的穩定性及包

15、封率的影響Fig 1 Influence of transonic time and transonic power on the stability of SLN and the entrapment efficiency of PTX in the PTX-SLN由圖可見超聲時間越長包封率越高，但在20min后包封率變化很小，穩定性變化也不明顯。實驗過程中發現超聲時間超過5minSLN溶液透明度變好，SLN粒徑變小。所以本實驗采用超聲20min為操作條件，并且超聲后用0.45m微孔濾膜過濾除去鈦顆粒雜質。由圖可知超聲功率越大，SLN穩定性越好，但包封率反而降低，原因可能是脂質骨架材料過于分

16、散，單獨以小粒子的狀態存在膠體溶液中，進而與藥物結合的脂質材料變少，游離藥物增加。操作中還發現功率400W以上SLN溶液變成泡沫狀，超聲探頭有空打現象，不易采用。所以本實驗采用超聲功率300W為操作條件。3.3 乳化劑及助乳化劑的處方選擇通常情況下，粒徑隨乳化劑用量增加而降低。高濃度的乳化劑在乳化過程中可以降低表面張力和促進粒子的分散。但是如果乳化劑過多，則可能出現其他形式的體系，如增溶分子（乳化劑單體）、膠束（SDS）或脂質體等。乳化劑豆磷脂用量初步確定在100mg200mg之間，具體用量在正交設計中作進一步考察。本實驗以包封率及穩定時間為考察指標篩選助乳化劑，結果見圖2。實驗中發現將乳化劑

17、豆磷脂與助乳化劑Pluronic F68或Tween 80混合使用，包封率要比單獨使用豆磷脂時高，穩定性更好。助乳化劑單獨使用Pluronic F68與豆磷脂結合時，SLN溶液混濁、粒徑偏大。單獨使用Tween 80與豆磷脂結合時，穩定性不好，包封率相對較低。所以本研究采用助乳化劑Pluronic F68與Tween 80相結合的試驗條件，總用量為3（w/v %），其配比及乳化劑豆磷脂的用量在處方優化中作正交設計進一步考察。圖 2 助乳化劑對紫杉醇固體脂質納米粒的穩定性及包封率的影響Fig 2 Influence of coemulsifier on the stability of SLN

18、and the entrapment efficiency (EE) of PTX in the PTX-SLN3.4 脂質材料的處方選擇脂質材料對SLN的影響很大，脂質材料用量過小，包封率低而且溶液不穩定。脂質含量超過了510，則會導致乳勻效率的降低，粒子聚集增加，所制備產品的粒徑較大，其中還有相當數量的微米級粒子，同時粒徑的分布更廣。通過對脂質材料的初步實驗，結果表明使用硬脂酸作為脂質材料，SLN膠體溶液混濁，且硬脂酸SLN有顆粒懸?。皇褂媚懝檀甲鳛橹|材料，SLN包封率低穩定性不好。所以本實驗采用單硬脂酸甘油酯為脂質材料，其用量初步確定為100mg200mg，具體用量在正交實驗中作進一步

19、考察。3.5 輔料處方優化以脂質材料單硬脂酸甘油酯用量、乳化劑豆磷脂用量、助乳化劑Pluronic F68和Tween 80的配比為因素，包封率(EE)及平均粒徑(MD)為考察指標，穩定性、粒徑為參考標準，進行正交實驗，因素水平表見表1。采用L9（34）正交設計表進行處方篩選，見表2，實驗結果分析見表3。表 1 紫杉醇固體脂質納米粒輔料用量的因素水平表Tab 1 The factors and levels table of orthogonal design in preparing PTX-SLN表 2 正交設計結果Tab 2 Design and results of orthogona

20、l experiment表 3 正交設計的方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogona l experiment以包封率為指標，通過正交實驗直觀分析得出最佳輔料處方：單硬脂酸甘油酯150mg、豆磷脂100mg、Pluronic F68和Tween 80的配比為2:1。由方差分析知,這三個因素的影響程度依次為單硬脂酸甘油酯用量®豆磷脂用量®助乳化劑Pluronic F68和Tween 80的配比。其中脂質材料單硬脂酸甘油酯用量有顯著性影響；以平均粒徑為指標，直觀分析得出最佳輔料處方：單硬脂酸甘油酯100mg、豆磷脂100mg、Pluroni

21、c F68和Tween 80的配比為2:1。由方差分析知,這三個因素的影響程度依次為單硬脂酸甘油酯用量®豆磷脂用量®助乳化劑Pluronic F68和Tween 80的配比，但三個因素均無顯著性差異。3.6 質量評價結果通過單因素及正交設計確定最佳輔料處方：SLN1：單硬脂酸甘油酯100mg、豆磷脂100mg、Pluronic F68和Tween 80的配比為2:1；SLN2：單硬脂酸甘油酯150mg、豆磷脂100mg、Pluronic F68和Tween 80的配比為2:1。以粒徑、zeta電位、包封率為考察指標，對其質量（光照、高溫滅菌、冷凍）進行評價，結果見表4。表

22、4 光照、高溫滅菌、冷凍對最佳處方穩定性的影響Tab 4 The influences of light, sterilization, freezing on the stability of SLN1 and SLN2由結果可見，光照后粒徑增大，zeta電位和包封率略有降低，兩種處方的固體脂質納米粒變化差異較小，但考慮到長期存放，應將樣品避光保存；滅菌后粒徑、zeta電位、包封率變化不明顯，在生產中完全可以進行滅菌操作；冷凍后粒徑、zeta電位變化較大，包封率也有所降低，原因可能是冷凍后樣品發生凝聚，待解凍后納米粒沒有完全分散，并且有少量納米粒遭到破壞。綜上所述，應將紫杉醇固體脂質納米粒分

23、散液滅菌后冷藏、避光保存。4 討論本研究還考察了將水相滴加入油相時的滴加速度，結果表明滴加速度對SLN的包封率及穩定性沒有顯著影響，但滴加速度超過10mL·min-1，制得初乳混濁，油層沒有完全分散開，與水層分離。水相滴加太慢不易操作并且在高溫攪拌時易揮發，得到初乳濃度大，不易超聲分散。所以本實驗確定3 m·min-1為最佳條件。脂質材料在常溫下為固態，制備溫度應控制在脂質熔點以上，使藥物和脂質混合熔融。并且乳化溫度會影響乳化劑的乳化能力，溫度過高會破壞乳化效果。乳化溫度在75±2時為最佳條件，被本實驗采用。Westesen等人研究出納米粒的載藥量一般在1%5%之

24、間4，也有研究將輔酶Q10、環孢菌素5裝載進納米粒中，載藥量可達20。本實驗中紫杉醇固體脂質納米粒的載藥量在6以下，這可能是由于紫杉醇在熔融脂質體中溶解度較小，兩者沒有完全混勻，超聲分散時藥品暴露于納米粒外造成載藥量低甚至空載。一般說來，要想得到較高的載藥量，藥品在熔融納米粒中應該有較高的溶解度，因為在固體脂質納米粒冷卻之后，藥品的溶解度會隨之降低6。最佳處方的穩定性期限可以達到4個月，粒徑由159nm增加到327nm，包封率下降8.4%，4個月后出現絮狀沉淀。有文獻7表明氯氮平固體脂質納米粒在25%3.5%。納米膠體分散液的穩定性是目前納米制藥領域所面臨的重大問題之一，其影響因素眾多，如脂質

25、材料及乳化劑的用量，制備方法，放置條件等都制約著其穩定性。Mehnert等人通過試驗證明納米分散液中脂質粒子從亞穩態轉變為穩態的過程中，由于粒徑較小及乳化劑的存在導致藥物從納米粒中溶出。Cavalli等人研究8在固體脂質納米粒滅菌過程中，如果使用了聚合物泊洛沙姆系列在121下滅菌，納米粒會被破壞。原因可能是此溫度已超過了聚合物的臨界絮凝溫度，造成納米粒穩定性降低，粒子聚集形成絮狀沉淀，所以本實驗采取100下滅菌，延長滅菌時間，結果納米粒分散液的粒徑、zeta電位均無明顯變化，可以為注射劑生產中的滅菌操作提供可靠、準確的滅菌條件。Reference1 FENG SS, HUANG GF. Eff

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28、oading capacity and sustained release potential J. J Control Release, 1997, 48:223-236.5 PENKLER L, MÜHLEN RH, RUNGE SA, et al. Pharmaceutical cyclosporine formulation with improved biopharmaceutical properties, improved physical quality and greater stability, and method for producing said form

29、ulation J. W O, 1999, 99:56733.6 RAINER HM, KARSTEN M, SVEN G. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery-a review of the state of the art J. Eur J Pharm Bio, 2000, 50:161-177.7 VENKATESWARLU V, MANJUNATH K, Preparation, characterization and in vitro release kinetics of clozapine s

30、olid lipid nanoparticles J. J Control Release, 2004, 95: 627-638.8 CAVALLI R, CAPUTO O, CARLOTTI ME, et al. Sterilisation and freeze-drying of drug-free and drug-loaded solid lipid nanoparticles J. Int J Pharm, 1997, 148:47-54.圖 1 超聲時間及功率對紫杉醇固體脂質納米粒的穩定性及包封率的影響Fig 1 Influence of transonic time and tr

31、ansonic power on the stability of SLN and the entrapment efficiency of PTX in the PTX-SLN圖 2 助乳化劑對紫杉醇固體脂質納米粒的穩定性及包封率的影響Fig 2 Influence of coemulsifier on the stability of SLN and the entrapment efficiency (EE) of PTX in the PTX-SLN表 1 紫杉醇固體脂質納米粒輔料用量的因素水平表Tab 1 The factors and levels table of orthogonal design in preparing PTX-SLNLevelsABCStearic acid glyceride /mgLecithin/mgPluronic F68：Tween 8011001001:121501501:232002002:1表 2 正交設計結果Tab 2 Design and results of orthogonal experimentNO.ABCDEE/%MD/nm1111186.31762122281.21813133385.41934212392.61845223193.52786231287.135773132