1、農業生物技術學報 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(5):810815 研究論文白菜 WRKY 轉錄因子 cDNA全長的克隆及分析 *王彥華1,侯喜林2*,申書興12.南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室， （1.河北農業大學園藝學院， 保定 071001； 南京 210095）摘要：參照擬南芥 利用 RTPCR及 RACE技術克隆了白菜 WRKY轉錄因子基因保守序列設計引物， 轉錄因子基因 cDNA 全長， 命名為(GenBank登錄號為 AY836002)。序列白菜 分析發現， 與擬南芥 基因核苷酸序列長 980bp， 推導的氨基酸

2、序列編碼 285 個氨基酸殘基， 氨基酸序列的同源性為 74%， 與擬南芥接種后 612h， 白菜同源性為59%； 與其它植物WRKY基因的同源性則較低。Southernblot 顯示該 基因的表達量最高。用2mmol/L的水楊酸處理后 28h， 基因在白菜基因組中為單拷貝。半定量 RTPCR分析表明， 以及用霜霉病菌水楊酸； RACE； 關鍵詞： 白菜； 轉錄因子； 半定量RTPCR文章編號：S188A10061304(2007)05081006中圖分類號：文獻標識碼：CloningandCharacterizationofAFulllengthcDNAofWRKYTranscription

3、FactorGenein121WANGYanhua,HOUXilin*,SHENShuxingPCRprimersweredesignedbasedontheconserveddomainoffulllengthcDNAofWRKYtranscriptionfactorwasclonedfromcationcDNAend(RACE)techniques.Sequenceanalysisindicatedthatdentitywas74%and59%togenomerespectively.transcriptionfactorsalicylicacidRACEsemiquantitativeR

4、TPCRandgenesofWRKYtranscriptionfactor.TheusingRTPCRandrapidamplifigene(GenBankaccessionnumber:AY836002)respectively.Thededucedaminoacidsequenceofwasacconsistedof980nucleotides(nt),anddeducedaminoacidsequencecontaining285aminoacids.FurthercomparisonshowedthatitsigenehaslowerhomologywithotherplantWRKY

5、genes.SouthernblottinganalysisindicatedtherewasasinglecopyinSemiquantitativeRTPCRdemonstratedthatthecorrespondingmRNAofcumulatedmostabundantly28haftertreatmentupon2mmol/Lsalicylicacid,and612hafterinfectionbyWRKY 轉錄因子是一類在植物中起特異作用 的轉錄調控因子，其名稱來源于其蛋白含有高度保守的 60 個氨基酸組成的 WRKY 結構域 （郝中娜和 這類 2006）陶榮祥， 。 自上個世紀

6、九十年代中期以來，煙草、 大麥、 水 基因已在甘薯、 野燕麥、 歐芹、 擬南芥、 稻、 棉花等植物中被克隆(Chen2003Zhang,2004Xu心序列為(T)TGAC 的 W 盒結合， 激活下游基因的2000表達， 從而開啟植物的防衛體系(EulgemYu2001Chen2002)。WRKY 轉錄因子 還影響植物的衰老、 抗脅 除參與植物的抗病反應外，,迫能力、 生長和發育及信號傳導過程2000Sun2004)。研究2004Li2004Xu,2006)。WRKY 基因在植物體內并非組成型表達，而是受外界環境的激發 而誘導表達。生物脅迫如病原物及其誘發因子(YoWRKY 轉錄因子通過與抗病基

7、因啟動子中核 表明，*基金項目： 高等學校博士點科研基金（No.20030307021） 資助。*通訊作者。Authorforcorrespondence.博士， . 教授， 主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術研究。Email： 20070130 接受日期： 20070404 收稿日期：第 5期 王彥華等: 白菜WRKY轉錄因子cDNA全長的克隆及分析811da2002Kalde2003Wang2005)、 用 Trizol(MDBio)試劑法。 防衛反應信號分子如水楊酸及其功能類似物(Dong、 環境脅迫如低溫、 高溫、 高鹽和創傷(仇 玉萍等，2004)均能誘導 WRKY基因的表達。 這些結

8、果表明，WRKY 基因編碼的轉錄調節蛋白具有多種 生理功能，在植物的發育調節和防衛反應中起重要 作用。白菜)霜霉病 是由專性寄生菌Pers.Fr） 引起的一種真菌病害，選用抗病品種是解決這一病害 的最有效途徑。 近年來， 植物抗真菌病害基因工程研 究日益受到重視，而目的基因的克隆是轉基因育種的基礎與關鍵。本研究以水楊酸 （SA） 處理后的白菜 為實驗材料，在已獲得的 WRKY 基因 cDNA 片段的基礎上 （王彥華等， 2005）， 采用 RACE(rapidamplificationcDNAend)技術，獲得了白菜 WRKY轉錄 因子 cDNA 全長序列， 并對該基因的拷貝數及誘導 表達規律

9、進行了分析，為白菜抗霜霉病機制的深入 研究提供基礎資料，并為白菜抗病基因工程提供了 基因資源。1 材料和方法1.1 材料供試材料為蘇州青白菜ssp.抗病自交系， 由南京農業大學白菜課題組提供。大腸桿菌)菌株 JM109 由本實驗室保存； 質粒載體 pMD18TDNA聚合酶、限制性內切酶、RNaseFreeDNase玉、 AgaroseGelDNAPurificationKit、 AMV 反轉錄試劑盒等均購自 TaKaRa 公司； DigDNALabelingandDetectionKit 購自 Roche 公司。 1.2 植物材料的準備將白菜種子播種于裝有滅菌基質的穴盤中， 人 工氣候箱中按照

10、光照 12h、黑暗 12h 光周期， 2025下培養。幼苗兩片真葉時，用 2mmol/LSA KOH 調節 pH 至 6.5） 進行噴霧處理， 處理后分別于 0、2、 4、 8 和 12h 提取葉片總 RNA。 1.3 接種液制備及接種方法參照程永安和何桂蘭 （1995） 的方法，對單株采 用噴霧接種， 接種后在 20黑暗中保濕 24h 后， 揭 掉遮光物， 在 2025、 相對濕度 85%5%培養，分別于接種后 0、4、 6、 12、 24 和 48h 提取葉片總 RNA。 1.4DNA 和 RNA 的提取DNA 的提取采用 CTAB 法，總 RNA 的提取采 1.5RTPCR利用 RNas

11、eFreeDNase玉去除總 RNA 中痕量DNA 污染， RT 反應參照大連 TaKaRa 生物公司的 TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1 試劑盒說明 書進行。根據已獲得的白菜 部分 cDNA 的序列 （王彥華等， 2005） 設計專一反向引物 W4， 以擬 南芥cDNA5 保守氨基酸設計正向簡并引物 W5。在 20 滋L 的反應體系中加入上述 RT 反應液 2 滋L，正反向引物 W5 和 W4 （皆 10pmol/滋L） 各 2 滋L， 另有 1伊PCRBuffer， 200 滋mol/LdNTP， 2.0mmol/LMgCl2， 1UDNA 聚合酶。 PCR 反應程序

12、： 94變性 1min 后， 9430s， 561min， 722min30s，循環 35 次， 7210min； 4 保存。 1.63RACE參考 Li2002） 的方法， 根據已獲得的白菜 WRKY 轉錄因子 cDNA 片段，設計一條正向引物 W3，通用引物 M4 為反向引物，退火溫度為53， PCR 反應體系同上。 1.75RACE參考李秋莉等 （2001） 的方法， 根據已獲得的白 菜 部分 cDNA 的序列 （表 1）， 在靠近 3 端一側，設計一條 5 末端磷酸化反轉錄引物 SRTP。 在遠離 3 端，設計兩條反向嵌套 PCR 引物 W6 和W7；在 SRTP 近端, 設計兩條正向

13、嵌套 PCR 引物 W8 和 W3。 第 1輪 PCR 以 cDNA環化反應液為模 板， 正反向引物為 W8 和 W6， 退火溫度為 50。表1白菜基因克隆引物Table1PrimersforcloningcDNAfrom引物名稱 引物序列 （53） 序列長度/bpPrimerPrimersequenceSequencenamelengthW2TGGAGRAARTAYGGNCARAAR21W18FGCTCCATTAACCTCCCAGAT20W3CGAAAGACTCAAAGTTCACAG21W4TGCGTCCCTTCGTATGTAGC20W5GCMWSWGARYTSCGNGAGGAGCT23W6

14、TCTCCCAGACTGCTGCTAACA21W7AGCTCCTCTCGTAACTCACTT21W8GGATCAAGCACTGTGACTTTG21SRTP(P)ATAGCAGCCGCAA 13N=A/G/C/T,R=A/G,Y=C/T,S=G/C,W=A/T,M=A/C（用812農 業 生 物 技 術 學 報 2007 年第 2 輪 PCR 除正反向引物為 W3 和 W7，退火溫 度為 54。1.8 目的片段的回收及克隆片段回收按照 TaKaRa 回收試劑盒的使用說明 進行。回收的 DNA 片段連接到 pMD18T 載體 （TaKaRa） 上。連接產物轉化感受態大腸桿菌用上述特異 JM109，

15、 藍白斑篩選。煮沸法提取質粒， 隆的片段為白菜 基因的 3 末端。5RACE進行嵌套式 PCR 擴增，第 1 輪擴增未獲得單一條 帶，第 2 輪擴增得到了長度為 195bp 的單一條帶5 端為 SRTP 引物到 W7 引物間的一段反 （圖 3），3 端與 向序列， 已知序列的 5 端有 23bp 的重疊區，說明克隆的片段為白菜 端序列。基因 5引物在相同條件下進行 PCR 擴增， 瓊脂糖凝膠電泳 檢測插入片段的大小。 1.9Southern 雜交用限制性內切酶玉芋和 玉完全消化 20 滋g 基因組 DNA（37 過夜）， 0.8%瓊脂 糖凝膠電泳 12h（ 1V/cm）， 使酶切產物充分分開，

16、 利 用堿性轉移液進行轉膜。探針的標記、雜交、 洗膜及 顯色處理均按照 DigDNALabelingandDetectionKit(Roche)說明進行。1.10 半定量 RTPCR 分析方法選取保守的延伸因子 作為內標基因 (王彥華等，2006)，分別將 SA處理后 012h 及霜霉病 接種后 048h 的葉片總 RNA 進行反轉錄反應；通 過調整模板濃度，使 的 PCR 擴增產物量一 致；最后以內標基因 的引物和重新設計的白菜基因片段的引物（預期片段長度為640bp） 進行雙重 PCR 分析。PCR 擴增程序為： 94 預變性 5min；9430s， 5840s， 721min， 29 個

17、循環；72延伸 10min。 1.11 序列測定及分析序列測定由上海博亞生物技術公司在 ABI377測序儀上進行；相似性比較在 NCBI 站點上用 BLAST 完成； 開放閱讀框 （ORF） 在 NCBI 站點上用ORFfinder 進行分析；利用 SMART 分析推導蛋白 的結構域，利用 ExPASy(expertproteinanalysissystem)分析推導蛋白的分子量及等電點。2 結果和分析2.1基因 cDNA 全長的克隆根據擬南芥靠近 5 端的保守氨基酸設計正向簡并引物 W5， 以獲得的白菜的cDNA特異序列設計專一反向引物 W4，進行 PCR 擴增， 得到了長度為 550bp

18、的擴增產物 （圖 1）。 將該 片段與原先獲得的白菜基因 cDNA 片段進行拼接，得到了長度為 724bp 的 cDNA 片段。 3RACEPCR 擴增獲得了一條 201bp 的條帶（圖 2），與 RTPCR 獲得的 片段具有 58bp 的 重疊區，并且包含 15bp 的 poly(A)結構， 表明所克 圖 1.RTPCR擴增結果 Fig.1.TheresultofRTPCRM,markerDL20001,PCRproductsusingprimerW4andW5.圖 2.3RACE擴增結果 Fig.2.Theresultof3RACEM,markerDL20001,PCRproductsof

19、3RACEusingprimerW3andM4.圖3.5RACE擴增結果 Fig.3.PCRproductsof5RACEM,markerDL20001,thefirstPCRamplification2,thesecondPCRamplificationproducts.根據上述 PCR 及 RACE的擴增結果，進一步第 5期 王彥華等: 白菜WRKY轉錄因子cDNA全長的克隆及分析813根據 5和 3序列， 設計特異引物:W1F:5GAACTTTTTGTAATGGACTGTTCT3W1R:5CGCTTTTACTCCATTTTAGAGGAA3。進行全長 cDNA的擴增，最終獲得了 980bp

20、 的 白菜 基因 cDNA 全長序列 （圖 4）， 命名為。在 NCBI 站點上用 ORFfinder 分析的開放閱讀框 （ORF）， 表明該基因的 5端含有 12bp 的前導序列區，13870bp 構成一個完 整的開放閱讀框架，編碼 285 個氨基酸殘基的蛋白 質 ， 含有 WRKY 轉錄因子的保守結構域 WRKYGQK； 然后是 110bp的 3端尾隨序列區 。 將 該序列提交 GenBank， 登錄號為 AY836002。圖4.基因 cDNA全長的擴增Fig.4.PCRamplificationofthefulllengthcDNAofgeneM,markerDL20001,PCRpro

21、ductsusingprimerW4andW52.2基因的序列分析用 BLAST 在 GenBank 上對進行同源性檢索發現， 其核苷酸序列與擬南芥 的同源性為 89%，與擬南芥 的同源性為84%， 與其它植物的 WRKY 轉錄因子僅在小的片段 區域存在同源性。推導氨基酸序列的 BLAST 分析 結果發現，克隆的白菜 基因與擬南芥的同源性為最高， 但也只有 74%， 與擬南芥的同源性為 59%，與擬南芥其它的WRKY 基因的同源性在 30%46%之間。而與其它 植物 WRKY 基因如傷誘導的煙草 WRKY 轉錄因 子基因 的同源性為 40%，與水稻的一個可能 的 WRKY 蛋白的同源性也是 4

22、0%； 與一個 TMV 誘 導的煙草應答基因的同源性則為 48%。 2.3基因的蛋白結構特征分析利用 SMART 進行基因結構分析發現，白菜基因的 N 端由 3565 位氨基酸組成的CC(coiledcoils)模體， CC 模體在蛋白質互作中起重 要作用；160220 位氨基酸為一個典型的 WRKY 結 構域，148218位氨基酸為一個富含半胱氨酸 （C） 和 組氨酸 （H） 的 C2H2 型的鋅指結構，因此， 應該屬于 WRKY域類。利用 ExPASy(expertproteinanalysissystem)分 析白菜 基因，推導的蛋白分子量為 31.75kD， 等電點 （pI） 為 7.

23、34， 表明該蛋白為一中性 蛋白。 2.4基因的拷貝數驗證以蘇州青白菜的基因組 DNA 為模板進行 PCR 擴增，得到了大小為 447bp 的、含有內含子的基因片段。將該片段回收純化， 并進行探 針的標記。選取在基因中無酶切位點的玉芋和含有 1 個酶切位點的 玉分別對白菜基因組 DNA進行酶切，按照方法中所描 述的 Southern 雜交程序進行雜交分析。如果玉和 芋酶切產 物應出現 1 玉酶切產物應出現 2條雜交帶。酶切及雜交結果見圖 5， 從圖中可以看出玉和 芋酶切產物均出現了 1 條較強的主帶，而玉酶切產物出現了 1 條強帶和 1 條弱帶，說明 基因在白菜基因組中為單拷 貝。圖 5.基因

24、Southernblot 結果Fig.5.Southernblottingresultof13,Suzhouqingdigestedwith玉,芋and玉,respectively.2.5SA 處理對基因表達的影響以 SA 處理后 0、 2、 4、 8 和 12h 葉片為材料， 以 內標基因的引物和基因片段的引物進行了雙重 PCR 擴增。從圖 6 中可以看出，SA 處理白菜后 28h 內其 mRNA 的積累一直維持較 高水平， 之后其表達明顯減弱，處理后 12h 的表達 量只有 8h 的 1/3 左右。說明 SA 處理快速誘導了基因的表達。2.6 霜霉病菌接種處理對 基因表達的影響814農 業

25、 生 物 技 術 學 報 2007 年4、 6、 12、 24、 48 和 72h 利用霜霉病菌接種后 0、 葉片為材料 ， 以內標基因的引物和基因片段的引物進行了雙重 PCR 擴增。h 一直保持著較高的表達水平(Yu2003)。煙草的和2001Dong亦受 SA2mmol/LSA 處理后 30min 其 mRNA 的快速誘導，從圖 7 中可以看出，霜霉病菌接種后 4h 內其mRNA開始積累， 接種后 6h 達到高峰， 直至接種后 12 和 24h 后其表達明顯減弱，直至接種后 72h 一 直維持低水平表達。圖 6.SA處理后不同時間 基因的表達 Fig.6.Timecourseanalysi

26、sofgeneexpressionupontreatmentwithSAM,markerDL2000.圖 7.接種霜霉病菌后不同時間 基因的表達 Fig.7.TimecourseanalysisofgeneexpressionuponinoculationwithM,markerDL2000.3 討論在擬南芥 WRKY域中等均受 SA 的快速誘導，2mmol/LSA 處理后 24h 其 mRNA 積累 均達到高峰。特別是 ， 在處理后 1h其 mRNA即有明顯的積累，直至處理后 8參 考 文 獻ChenCHandChenZX.Isolationandcharacterizationoftwo開

27、始積累， 2h 即達到高峰(Chen,2000)。 本實驗中，以 2mmol/LSA 處理白菜后 28h 內其 mRNA 的積累一直保持較高的水平，之后其表達明顯減弱， 處理后 12h 的表達量只有 8h 的 1/3 左右。說明在 白菜基因同樣受 SA 的快速誘導。在擬南芥 WRKY芋中， 用霜霉病菌接種抗病生態型 Columbia（ Col0） 和均受到不同程度的誘導，但是誘導速度延遲于 SA 和 在接種 4h 后，其 mRNA 積累達到高 峰 ； 和 在接種后 6h，其 mRNA 和則分別在接種后 24h和 48h達到積累高峰。這些基因的誘導表達 模式反映了它們參與不同保護信號轉導途徑中的

28、抗 病反應(Kalde2003)。 在擬南芥 WRKY域中，在 用番茄細菌性潰瘍病菌接種后 24h 和其mRNA 表達量迅速增加， 和 在接種后 4h 其 mRNA和在接種后 8h 表達量最高， 而 和在接種后 2h 其 mRNA積累即達到了高峰。但 是只有 和 在接種后 24h 尚維持高 和 在接種后 24h 已經檢測不到其表達(Dong2003)。水稻的 基因受非親和稻瘟病菌的快速誘導，接種后 3h 其mRNA即有明顯的積累， 接種后 12h 積累達到高峰(Wang2005)。在本實驗中， 用霜霉病菌接種蘇州青白菜抗病自交系 4h 基因開始表達， 6h 后其 mRNA積累達到高峰， 一直維

29、持至接 種后 12h， 其誘導速度明顯延遲于 SA處理。這與擬 南芥 WRKY芋中的 和 在接種霜霉 病菌后及 WRKY域中和在接種番茄細 菌性潰瘍病菌后的的表達情況類似。按照 Kalde(2003) 劃分的基因表達模式， 26h 內 mRNA 積 累迅速達到高峰的屬于早期應答基因，說明白菜基因的表達屬于對霜霉病菌早期應答的基因，在抗霜霉病的信號轉導中具有重要的作用。pathogenandsalicylicacidinducedgenesencodingWRKYDNAbindngproteinsfromtobacco(J).2000,42:387396第 5期 王彥華等: 白菜WRKY轉錄因子

30、cDNA全長的克隆及分析815ChenCHandChenZX.Potentiationofdevelopmentallyregulatedplantdefenseresponsebyapathogeninducedtranscriptionfactor(J).2002,129:706716ChengYA（程永安） andKeGL(柯桂蘭).FactorsaffectingevaluationofChinesecabbageresistancetodownymildew(J).(西北農業學報),1995,4(4):6972(inChinesewithEnglishabstract)DongJX,

31、ChenCHandChenZX.Expressionprofilesofthegenesuperfamilyduringplantdefenseresponse(J).2003,51:2137EulgemT,RushtonPJ,RobatzekSandSomssichIE.TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors(J).HaoZN（郝中娜） andTaoRX(陶榮祥).StudyofWRKYtranscriptionfactorsuperfamily(J).(生命科學),2006,18(2):175179(inChinesewithEnglis

32、habstract)KaldeM,BarthM,SomssichIEandLippokB.MembersoftheWRKYgroup 芋transcriptionfactorsarepartofdifferentplantdefensesignalingpathways(J).2003,16:295305LagaceMandMattonDP.CharacterizationofaWRKYtranscriptionfactorexpressedinlatetorpedostageembryosof2004,219:185189LiJ,BraderGandPalvaET.TheWRKY70tran

33、scriptionfactor:Anodeofconvergenceforjasmonatemediatedandsalicylatemediatedsignalsinplantdefense(J).2004,16:319331LiQL,GaoXR,YuanXD,LiuDWandAnLJ.Rapidamplificationof3cDNAendofSuaedaliaotungensisbetainealdehydedehydrogenaseusingonestepPCR(J).2002， 24（ 2）：179181LiQL(李秋莉),GaoXR(高曉蓉),FanQ(范琦),YuanXD(袁曉東

34、),LiuDW(劉大偉)andAnLJ(安利佳).Rapidamplificationof5cDNAendofbetainealdehydedehydrogenasebyinversenestedPCR(J).(高技術通訊),2001,11:1719(inChinesewithEnglishabstract)QiuYP(仇玉萍),JingSJ(荊邵娟),FuJ(付堅),LiL(李璐)andYuDQ(余迪求).Cloningandanalysisofexpressionprofileof13WRKYgenesinrice(J).科學通報),2004,49:18601869(inChinese)SunCX,PalmqvistS,OlssonH,VorenM,AhlandsbergSandJanssonC.AnovelWRKYtranscriptionfactor,participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugarresponsiveelementsoftheisolpromoter(J).2003,15:20762092WangHH,XieK,WuKLandGuoZJ.IsolationofariceWRKYgenewhoseex