1、Real Real-time time PCRPCR Principle 羅氏診斷產(chǎn)品 羅氏診斷產(chǎn)品(上海 上海 有限公司 廣州辦事處應用科學部應用專員 楊奇志258www.roche-applied- 實時熒光定量 實時熒光定量PCR PCR PCR技術原理 技術原理普通 PCR 技術原理基于嵌入式染料的熒光定量 PCR 原理基于探針的熒光定量 PCR 原理 熒光定量 PCR 技術平臺的功能開發(fā) 實時熒光定量 實時熒光定量PCR PCR PCR技術原理 技術原理普通 PCR 技術原理基于嵌入式染料的熒光定量 PCR 原理基于探針的熒光定量 PCR 原理 熒光定量

2、PCR 技術平臺的功能開發(fā)PCR 原理 信號放大原理PCR 產(chǎn)物的電泳檢測和分析 SYBR Green IHybProbe TaqMan Real-time PCR原理 實時熒光定量 實時熒光定量PCR PCR PCR技術原理 技術原理普通 PCR 技術原理基于嵌入式染料的熒光定量 PCR 原理基于探針的熒光定量 PCR 原理 熒光定量 PCR 技術平臺的功能開發(fā) SYBRGreen I Cp(Crossingpoint or Ct (Cycler threshold 實時熒光定量 PCR 的原理公式N =N 02n =N0(1+En logN= log(1+En +logN0 logN 0=

3、 -nlog(1+E+logNCp =n= -logN 0/log(1+E +logN/log(1+E(Y=kX+b結論:Cp 值與模板起始濃度的負對數(shù)成線性關系N :擴增產(chǎn)物量 ;N 0:啟始模板量 ; N :循環(huán)數(shù) ; E :擴增效率 (0 E 1 實時熒光定量 實時熒光定量PCR PCR PCR技術原理 技術原理普通 PCR 技術原理基于嵌入式染料的熒光定量 PCR 原理 基于探針的熒光定量 PCR 原理熒光定量 PCR 技術平臺的功能開發(fā)FRET 現(xiàn)象 (Fluorescence resonance energy transfer TaqMan probe TaqMan probe p

4、rinciple Roche Applied Science 16 雜交探針HybProbe羅氏專利性技術 雜交探針 for sequence specific detection of DNA Fluorescein LC Red Denaturation Annealing Elongation End of Elongation Roche Applied Science 17 實時熒光PCR檢測結果 Roche Applied Science 18 New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探針 Denaturation phase:

5、 SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q R = Reporter (Fluorescein Q = Quencher 5 3-p Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to its complementary target R primer 3 Q 3-p 5 5 Roche Applied Science 19 實時熒光PCR技術的優(yōu)勢 實時熒光PCR技術的優(yōu)勢 PC

6、R 特異性強：引物和探針“雙保險”，避免檢測的假陽 特異性強 性。 靈敏度高：自動化儀器收集熒光信號，避免了許多 靈敏度高 人為因素干擾。 避免污染：全封閉反應，無須PCR后處理。 避免污染 實現(xiàn)定量：運用標準品獲得標準曲線，結合Cp值進 實現(xiàn)定量 行準確定量。 操作簡便：實時監(jiān)測反應結果，不接觸有害物質(zhì)。 操作簡便 快速：反應時間<40分鐘。 快速 Roche Applied Science 20 實時熒光定量 實時熒光定量PCR PCR PCR技術原理 技術原理普通 PCR 技術原理基于嵌入式染料的熒光定量 PCR 原理基于探針的熒光定量 PCR 原理 熒光定量 PCR 技術平臺的功

7、能開發(fā)各種熒光 PCR 方法的特點SYBR Green I染料法:通用性好 ,靈敏度高,只要在普通 PCR 反應體 系中加入熒光染料,稍優(yōu)化即可,可通過做溶解曲線來 分析擴增產(chǎn)物 的成分; 特異性差 ,模板起始濃度不同,本底信號也不同,為提高檢 測的特異性,需要進行優(yōu)化工作。適合進行定性檢測。HybProbe 探針:特異性好 , 擴增效率高 ,并且可通過做溶解曲線來 分析突變和基因分型 ; 通用性不好 。適合定性、定量以及基因分型( SNP 分析。TaqMan 探針:特異性好 ,不能做溶解曲線分析; 通用性不好,擴增 效率因水解作用受影響,信號的產(chǎn)生不依賴于特定的溫度, 5-3外切 酶活力難測

8、定。無法直接進行溶解曲線分析, 適合定性、定量分析。 SimpleProbe 探針:特異性好 , 擴增效率高 ,熒光強度不高,適合做 溶解曲線來分析 點突變和基因分型。ResoLight Dyes(HRM高分辨率溶解曲線法 :分辨率非常高,可在 300bp 的擴增產(chǎn)物內(nèi)區(qū)分單堿基突變,主要用于發(fā)現(xiàn)未知的 SNP 突變 位點。配合未標記探針,可同時檢測已知突變并尋找未知突變。 可以區(qū)分不同的擴增產(chǎn)物(基因突變,基因分型, 基因多態(tài)性,非特異產(chǎn)物和引物二聚體熔點(Tm的定義:50%雙鏈DNA解鏈成單鏈時的 溫度 LC進行熔點曲線分析時,從低溫以0.1/s升溫至 95,并做連續(xù)熒光檢測,當50%DN

9、A解鏈成單鏈 時,熒光強度陡降,從而獲得相應的Tm 熔點曲線分析鑒定 PCR 產(chǎn)物熔點曲線分析(利用 SYBR Green I染料或雜交探針 染料或雜交探針 判別引物二聚體 使用 使用 SYBR Green I染料 Gel electrophoresisLightCycler Melting Curve Analysis 錯配 完全匹配溫度低溫中溫高溫熔點曲線分析點突變 熔點曲線分析點突變(SNP 分析 分析 突變(SNP 檢測-利用雜交探針 突變分析MismatchMismatchPerfect MatchPerfect MatchFluorescent Signal-dF/dT°

10、C TemperatureReal-time PCR 的定量的概念 相對定量 管家基因 管家基因(Housekeeping Genes定義編碼在細胞功能上活性必需的蛋白質(zhì)的一系列基因這些基因通常組成型表達 這些基因通常組成型表達, , 在所有樣本中表達水平接近 在所有樣本中表達水平接近, , 可用作管家基因 可用作管家基因(reference gene通過同一樣本中管家基因 RNA 對目的基因表達水平的校準 來衡量目的基因 RNA 的表達水平管家基因(參照基因的作用: 檢測是否樣本材料中 RNA 降解 糾正樣本加樣量的差異 校準 cDNA 合成速率 校正 PCR 抑制劑的影響 Relative

11、 Quantification with External Standard: Summary F l u o r e s c e n c e CyclesReferenceF l u o r e s c e n c eCyclesTargetUnknown SampleCyclesF l u o r e s ce n ceStandardsStandardsCyclesF l u o r e s c e n ceC r o s s i n g P o i n tLog ConcentrationC r o s s i n g P o i n tLog Concentration Quanti

12、fication Principles Overview Relative QuantificationPrincipleA calibratorcan be used for normalizationof the final results.It provides a constantcalibration point betweenseveral experiments thus correcting for run-to-runand lot-tolot differences. The calibratoris positive for targetand referenceand

13、musthave a constantexpressionratio of targetto reference.A calibrator provides comparison of many PCR experiments (used as a “positive control”. A calibrator corrects for differences in detection sensitivity between target and reference genes. It does not correct for differences in PCR efficiency be

14、tween the target and the reference gene.Calibrator Relative Quantification Normalized to a Calibrator Depends on e.g.; primer annealing, reversetranscription, ampliconlength and GC content PCR Efficency Relative Quantification Methods Effect of Efficiency DifferencesError Generation 246400%80700%264

15、00%8570%2740%830%1.6029500%13000%5710%2480%1045%408%1.703900%2260%1290%722%385%187%1.80500%365%260%179%116%67%1.90142%113%88%66%46%29%1.9570%57%46%35%25%16%1.97-2.00PCR Efficiency353025201510 Detection Cycle (nError Calculation(2n/En-1 x 100Dependence of Analysis Error on PCR Efficencyand CycleNumbe

16、rDetermination of Efficiency of Target and Reference LightCycler ®Data Analysis Target gene: CycAHousekeepinggene: PBGD Workflow: Analysis Results Gene Scanning Workflows Benefit of a homogeneous method Melting Curve Analysis Established and new applications Amplicon Melting Principle of gene s

17、canning by HRMGene ScanningExample 1: Target LPLH3SNP G T Amplicon 164 bp 72 samplesWildtypeGGTTGT Gene ScanningExample 2: Target MBL2Screening for sequence variants in 384 unknown samplesAmplicon 219 bp4 common and 2 rare groups of different sequences are found In literature, 3 polymorphic sites ar

18、e described, the most frequent alleles are the 4 variants:A C / G / GB C / A / GC C / G / A D T / G / G Gene Scanning 的應用方向StandardGenerate specific gene sub-fragments from sample-derived DNAObtain high resolution melting curve for whole ampliconClassify melting curves using auto-grouping or melting

19、 standards Sequence samples with unusual curve shapes and confirm new variantsOptionalSequence representative group members to define standardsInclude sequenced standards as control in subsequent runsUse spikes of wild-type DNA to fully differentiate homozygotesAdvancedInclude unlabeled probes for geno-or haplotypingUnlabeled Probe Melting Principle :Combination of ampliconmelting and specificprobe meltingDNA samplePCR,rapid cooling after last denaturation+ + T T C AA Gincreasing temperatureOligo MeltingAmplicon Meltingincreasing temperaturewildtype-specifi