1、益腦顆粒對衰老慢性腦缺血大鼠腦組織中VEGFVEGF表達(dá)的影響作者：鐘麗紅魏春敏李魯楊【摘要】目的研究益腦顆粒對衰老慢性腦缺血大鼠腦組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響，探討益腦顆粒治療慢性腦缺血的作用機(jī)制。方法采用D半乳糖（Dgal）注射誘導(dǎo)和永久性雙側(cè)大鼠頸總動(dòng)脈結(jié)低劑量益腦顆粒灌胃，并以尼莫地平為對照，免疫組化法觀察大鼠腦組 織VEGF的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組腦組織中VEGF表 達(dá)無明 顯改變（P 0 05）,益腦顆粒高、低劑量組表達(dá)升高（P V0.01）,尼莫地平組無明顯改變（P 0.05） o結(jié)論益腦顆粒能增加缺血腦組織中VEGF表達(dá)，而增強(qiáng)腦組織血管側(cè)支循環(huán)的建立，改

2、善 腦缺血。【關(guān)鍵詞】益腦顆粒；慢性腦缺血；衰老大鼠；VEGF（作者:單位:郵編:扎術(shù)（2VO）制備亞急性衰老大鼠慢性腦缺血模型。給予高、Abstract Objective To observe the effect of Yinao granule onVEGF in brain of chronic cerebral ischemia model of subacute aging rats, and explorethe mechanism. Methods D galactose (Dgal) injectio n and perma nent bilateral common ca

3、rotid artery occlusi on (2VO) were usedto made model of subacute agi ng rats. Model rats were feed with high and lowjdoseYinao granule, and nimodipine was selected as positive control. The expression ofVEGF was measured by immuohistochemical method. Results There was no differe neeof VEGF expressi o

4、n betwee n model group and control group (P 0,05) , there werehigh expressions in high and low Jdose Yinao granule groups (Pv 0.01) , and the highJdose group was superior to low dose group (P v 0.01 ) . There was no obvious changeof VEGF expression in nimodipine group. Conclusions Yinao granule can

5、improve theVEGF expression in brain of circulation in sufficiency to devel op the collateralcirculati on and play a p rotective role to perfective cerebral ischemia.【Key words Yinao granule; Chronic cerebral ischemia; Aging rats;VEGF持續(xù)性腦血流量下降引起多種細(xì)胞因子及抗凝因子比例失衡，是血 管 性癡呆、Alzheimer病和Binswanger等多種疾病發(fā)展過程中

6、的一個(gè)共同病理過程，盡快改善和恢復(fù)缺血損傷腦組織的血液供應(yīng)是慢性腦缺血治可以促進(jìn)腦部毛細(xì)血管增生，從而保護(hù)神經(jīng)元240益腦顆粒由黃 英、制首烏、銀杏葉、大黃、莪術(shù)、水蛭、三七等多味中藥組成。本方具有健脾益腦、補(bǔ)腎活血之功效，在改善老年慢性腦缺血患者頭 暈、頭沉、記憶力減退等自覺癥狀方面取得了較滿意的療效。本研究 應(yīng) 用衰老大鼠慢性腦缺血模型，通過評(píng)價(jià)益腦顆粒對模型動(dòng)物腦組織VEGF表達(dá)的影響,探討本方改善老年患者慢性腦缺血的作用O1材料與方法1.1動(dòng)物及分組給藥6周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重(200 20) g,由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成正常組、療的關(guān)鍵1。研究表明，血

7、管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)模型組、益腦顆粒高、低劑量組及尼莫地平組，每組12只。1 2藥品與儀器黃葩制首烏、銀杏葉、大黃、莪術(shù)、三七粉、水蛭北京拜爾迪生物公司提供（批號(hào)：00637）；尼莫地平片由山東新華 制藥 股份有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：0605173） 01.3實(shí)驗(yàn)方法131模型制備模型組、益腦顆粒高、低劑量組及尼莫地平組大鼠 以50mg/kg頸背部皮下注射0.5% Djgal生理鹽水溶液，誘導(dǎo)亞急性 衰老模 型，正常組用等量生理鹽水頸背部皮下注射。4 W后以10%的 水合氯醛0.35 ml/100g腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛，強(qiáng)力碘消毒,頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并套以“

8、 線永久性結(jié)扎，制備老年慢性腦缺血模型3, 4，并繼續(xù)皮下注射Dgal,正常組處理不變。術(shù)后給予硫酸慶大霉素4 000IU/100g肌內(nèi)注射，預(yù)防感染。132益腦顆粒的制備黃葩制首烏、 銀杏葉、 大黃、 莪術(shù) 等粗粉按55 ; 2:比例投料，分別加入10、&8倍量水，煎 煮提取3次，合并濾液，靜置沉淀24 m上清液濃縮成膏， 烘干、粉碎成細(xì)粉，加入水蛭粉（水蛭低溫烘干粉碎）和三 七粉（投藥量均為黃英的1/W）混勻，平鋪一薄層，紫外燈 照射45mim加入95%酒精，用12目篩制粒，60 C80 C干燥，整粒，益腦顆粒含生藥4 2g/g。133給藥 益腦顆粒以蒸f留水稀釋成30 mg/ml

9、和15 mg/ml混懸 液, 高、低劑量組分別按0 6和0.2 g kg-1 d-1灌胃給藥，尼莫地平 組以40mg kg-1 d-1給予尼莫地平混懸液（2 mg/ml）灌胃，模型組和正常組灌等中藥飲片購自山東省醫(yī)藥采購供應(yīng)站;D半乳糖（Dgal）由制作腦組織標(biāo)本。1 3 4測定方法 采用免疫組化染色(SP法)。兔抗大鼠的VEGF多克隆抗體1 100及SP法試劑盒購自武漢博士德生物公司，按SP法試劑盒性，并經(jīng)蘇木素復(fù)染細(xì)胞核對比染色。每次染色時(shí)均同時(shí)以 替代一抗作陰性對照。135圖像分析方法 應(yīng)用Leica QwinVS圖像分析軟件對切片進(jìn)行 圖像 分析。所有切片均在同一光強(qiáng)度下，同一放大倍數(shù)

10、下進(jìn)行分析。每例大 鼠測量3張切片，每張切片選定3個(gè)不同視野測定平均灰度。1 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件，數(shù)據(jù)以X士S表示，各組比 較采 用多樣本均數(shù)的方差分析。2結(jié)果正常組各腦區(qū)未檢測到VEGF陽性表達(dá)。模型組、益腦顆粒高、低劑 量組及尼莫地平組均有VEGF的陽性表達(dá)，益腦顆粒高劑量組VEGF表 達(dá)明顯增強(qiáng)，見圖1。模型組腦組織血管內(nèi)皮中VEGF表達(dá)(n=8,131.270拐286)與正常組(n=12, 124.910191)無明顯差異(P 0,05):與模型組比較，益腦顆粒高(n=11, 165,65 1.060) V低劑量組(n=11, 150,10 IO,64)VEGF表

11、達(dá)增高(PVO.OI ),尼莫地平組(n=10, 136,5437.417)表達(dá)無明顯變化(P 0,05 ),且益腦顆 粒高劑 量組優(yōu)于低劑量組(P V0.01)0服等量蒸f留水，每天兩次給藥,4w后，斷頭開顱取腦,說明進(jìn)行操作。所形成的復(fù)合物與DAB反應(yīng)后呈棕褐陽PBS液3討論VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥、腫瘤、缺血、缺氧等病理過程中發(fā)揮著重要的作用。慢性腦缺 血并誘導(dǎo)血管的再生。血管的再生有利于側(cè)支循環(huán)的建立， 并對缺血的 神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起到抑制作用。本結(jié)果表明，在亞急性衰老大鼠腦缺 血4W后，測定腦組織中VEGF的含量雖有增加，但與正常組無明 顯差異

12、，組的表達(dá)。可見益腦顆粒能有效促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究先采用Dgal誘導(dǎo)了亞急性衰老大鼠模型5再采用2VO制 作出慢性腦缺血模型，建立了亞急性衰老大鼠慢性腦缺血模型6， 造模后腦組織病理學(xué)呈缺血性改變，但未見明顯梗塞灶，實(shí)驗(yàn)過程中雖 出現(xiàn)部分大鼠死亡，但樣本量仍能滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。益腦顆粒以黃英為君，健脾益氣，制首烏、銀杏葉為臣，補(bǔ)腎填精 而 生髓健腦，輔以大黃、莪術(shù)、三七、水蛭等活血。中醫(yī)認(rèn)為氣血 互 根、脈為血之府補(bǔ)氣活血與行氣活血方藥具有促血管生成作用。 以往 研究表明， 黃英可有效提高心肌及腎臟VEGF的表達(dá) 7 本 研究結(jié)果 提示益腦顆粒可明顯提高衰老大鼠慢性腦缺血

13、模型腦組織 中VEGF的表 達(dá)，促進(jìn)毛細(xì)血管增生，增強(qiáng)缺血部位側(cè)枝循環(huán)的建 立，改善慢性腦缺血狀態(tài)，從而保護(hù)神經(jīng)元，降低腦損傷或腦萎縮機(jī) 率，提高老年人生活 質(zhì)量。【參考文獻(xiàn)】1李華軍，李威，邵延坤，等大鼠局灶性腦缺血/再灌注后時(shí)，由于缺血、缺氧的刺激，將在一定程度上促進(jìn)VEGF的表達(dá)經(jīng)益腦顆粒干預(yù)后表達(dá)明顯增加,且高劑量組要優(yōu)于低劑量VEGF的變化對缺血腦組織的影響J中國老年學(xué)雜志,2006；26(9):122930.2趙穎，王蘋,康立源慢性腦缺血病理機(jī)制與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展J沖國臨床藥理學(xué)雜志,2005;21 (5):385 63 Grasselli F,Basini G,Bussolati S,et al. Effects of VEGF andbFGF on proliferation and production of steroids and nitric oxide in procinegranulosa cellsJ.Reprod Domest Anim,2002;37 (6):362 8.4吳艷芝，沈瑞樂，郭鐵，等丁基苯酉太對老齡大鼠慢性腦缺血后HO21和VEGF表達(dá)的影響J中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,