1、人骨髓間充質干細胞對K562細胞增殖和化療敏感性的影響          作者：林玉梅，卜麗梅，楊少娟，高申，張桂珍     【摘要】  本研究比較K562細胞與正常人骨髓間充質干細胞（MSC）黏附培養前后細胞增殖、化療敏感性及MDR1變化，以尋找白血病耐藥與造血微環境的關系。對懸浮培養和與MSC黏附培養的K562細胞繪制細胞生長曲線；用流式細胞術測定細胞周期并觀察化學藥物對細胞存活率和凋亡的影響；用RT-PCR技術檢測MDR1基因表達。結果表明：與懸浮培

2、養比較，黏附培養K562細胞增殖受抑，G0/G1期細胞比例增加 (P<0.05)，S期細胞比例下降 (P<0.05)，G2/M期細胞比例增加(P<0.01)。在柔紅霉素（DNR）誘導的凋亡中，黏附培養組K562細胞凋亡受阻 (P<0.05)。黏附培養未誘導K562細胞MDR1基因表達，也未使K562/ADM細胞的MDR1基因表達發生改變。論文論文參考網結論： K562細胞與MSC黏附接觸共培養，可導致K562細胞生長抑制，并產生化療耐藥，其機制可能與MDR1無關。 【關鍵詞】  骨髓間充質干細胞Influence of Human Mesenchymal St

3、em Cells on Cell Proliferation and Chemo-sensitivity of K562 CellsAbstract  This study was aimed to compare K562 cell proliferation，chemo-sensitivity and alteration of MDR1 before and after  adhesive culture with MSC，so as to evaluate the relationship between chemodrug-resistance of leukem

4、ia cells and hemopoietic microenvironment. K562 cell  cultivated in suspension and  adhesively cultivated with MSC were  collected respectively  and cell proliferation curves were drawn; the cell cycle was determined by  flow cytometry; the  effect of chemotherapy on ce

5、llular viability and apoptosis of K562 cell was investigated，the  MDR1 gene expression was determined  by RT-PCR.    The results showed that  K562 cells adhesively cultivated with MSC were inhibited and cells in G0/G1  increased (P<0.05)，cells in S phase decreas

6、ed (P<0.05) and those in G0/G1 increased (P<0.01)，compared with that cultivated in suspension.In process of  daunomycin-inducing   apoptosis，K562 cell apoptosis in the adhesive culture with MSC was inhibited (P<0.05).MDR1 gene expression in K562 cells  was not induced or

7、 altered by adhesive co-cultivation.It is concluded that by co-culture of cell-cell contact with MSC，growth suppression and induction of chemo-resistance of K562 cells take place.The mechanism，however，seems not relevant with MDR1.Key words  mesenchymal stem cell; K562;  drug  resistan

8、ce; apoptosis;  MDR1    耐藥是根治白血病的最主要障礙，其發生機制及逆轉的研究一直是白血病的研究熱點，以往人們主要集中在對單個白血病細胞本身的分子生物學改變的研究，并取得了顯著成果，但在體內仍難克服耐藥的發生。近年來，隨著對骨髓造血微環境（hematopoietic microenviroment，HM）的認識不斷加深，發現骨髓基質細胞在白血病細胞惡性克隆的增殖、分化和凋亡中起重要作用1。而骨髓基質細胞的前體細胞骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是骨髓造血微環境中基質細胞的主要來源，對正常造血也具

9、有調控作用，但對白血病細胞的調節作用尚不清楚。本研究以人慢性髓細胞白血病K562細胞株為靶細胞，與正常人MSC共培養，觀察其對K562細胞增殖和化療敏感性的影響，以探討MSC與白血病耐藥的關系。材料和方法試劑柔紅霉素、阿霉素（DNR、ADM)，均購自Pharmacia公司；DMEM-LG、RPMI 1640培養液購自Gibco公司；FBS 購自Hyclone公司； RT-PCR試劑盒、蛋白酶K、RNA酶及瓊脂糖均購自Promega公司； PCR引物由上海生物工程公司合成。TRIZOL購自Invitrogen公司；Percoll(密度1.073 g/ml)，購自Amersham Bioscien

10、ces公司。碘化丙錠（PI）購自美國Coulter-Immunotech公司。人骨髓MSC的分離和培養骨髓MSC的分離、純化和擴增按Pittenger等2報道的方法進行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液5  ml，用Percoll分離液分離單個核細胞（MNC），以2.0×105/cm2細胞接種于75 cm2的Nunc培養瓶內，培養體系為含10%  FBS的DMEM-LG，置于37、5%  CO2飽和濕度的孵箱中進行原代培養。培養48小時后換液，除去非貼壁細胞，以后每3天換液1次。待覆蓋培養瓶底面積的80%以上時加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，按5×1

11、03/cm2傳代培養，每3天換液1次。2-4代細胞用于實驗。人骨髓MSC表面標志的鑒定將胰蛋白酶消化收獲的MSC以2×105個細胞分別與抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C和HLA-DR（PharMingen公司）室溫反應30分鐘，經PBS洗滌2次后與標記FITC的二抗避光反應15分鐘，細胞洗滌后懸浮于PBS中以備流式細胞儀分析。K562細胞與MSC黏附培養K562/ADM細胞株，購于中國醫學科學院血液學研究所，在ADM 1.0  g/ml的含10% FCS的RPMI 1640培養液中穩定生長。試驗前2周換用無ADM

12、的培養液培養。K562細胞株由本醫院中心研究室提供，培養體系同上。已傳代的MSC以1×104 /cm2接種于75 cm2的培養瓶中，待細胞貼壁呈融合狀態時在其上分別直接加入對數生長期的K562和K562/ADM細胞（1×105/ml）。48小時后先去除未黏附的白血病細胞，根據文獻報道方法3吹打收集黏附生長的白血病細胞。細胞生長曲線測定懸浮培養組 取生長狀態良好的K562細胞接種于24孔培養板，每孔1 ml，含1×104細胞，每3天換液1次。黏附培養組 已傳代的MSC接種于24孔培養板，每孔1 ml，含1×104細胞，待MSC完全貼壁融

13、合后，在其上直接加入懸浮生長的K562細胞1×104，體積同上。    每組均3天換液1次。在第1至8天分別收集各組K562細胞，臺盼藍染色記數活細胞數，每組有3個平行孔，取均值。最后以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制生長曲線。細胞周期的流式細胞術（FCM）測定分別取懸浮培養和黏附培養48小時的K562細胞2×106，用冷PBS洗2次，加入預冷70%乙醇固定，4過夜，RNase處理30分鐘后離心，PI染色30分鐘，用流式細胞儀檢測。每組實驗重復3次，取均數。黏附培養對K562細胞藥物敏感性的影響MSC接種于24孔培養板，分2組。待細胞貼壁呈

14、融合生長狀態時，在其上直接加入懸浮生長的U937細胞，48小時后計數1組K562細胞數。另1組與相同細胞數的懸浮培養組平行加入含不同濃度DNR（0.1-3.2  g/ml）的培養液，于24小時收集白血病細胞，通過臺盼藍排斥實驗檢測細胞活率。每組3個平行孔，取均數。細胞凋亡的FCM檢測不同濃度的DNR作用24小時后，分別收集懸浮和黏附培養組K562細胞 2×106，方法同細胞周期檢測，出現亞G1峰的細胞為凋亡細胞，獲得凋亡率。每組實驗重復3次，取均數。論文參考網 DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測不同濃度的DNR作用24小時后，分別收集懸浮和黏附培養組K562細胞 2×

15、106，加細胞裂解緩沖液（1     mmol/L  tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，200 mg/L蛋白酶K，0.5% SDS），在50保溫3小時，使細胞充分裂解，酚氯仿抽提DNA，在抽提液中加1/10體積的2  mol/L  naAc和2倍體積的乙醇，使DNA沉淀，-20過夜。4、1 000×g離心，DNA沉淀用TE緩沖液溶解，加入RNA酶200 mg/L，37保溫1小時，2%瓊脂糖凝膠電泳2小時，觀察DNA ladder形成。MDR1基因表達的RT-PCR測定MDR

16、1上游引物：5-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3；下游引物：5-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3，擴增片段157 bp。以-actin作為內參照（擴增片段418 bp）。用TRIZOL抽提總RNA，RT-PCR參照試劑盒說明書操作，反應條件：45逆轉錄45分鐘，94  AMV RT滅活和RNA/cDNA引物變性2分鐘。循環參數：94 30秒，60 1分鐘，68 2分鐘，40個循環后68再延伸7分鐘。取擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。統計學處理應用SPSS 10.0軟件分析結果，率的比較用2檢驗，兩樣本間均數比較用t檢驗。結 果MSC的生

17、長特點及免疫表型特征分離的骨髓單個核細胞于接種24小時時即可見大量貼壁略伸展的細胞，72小時后出現典型的紡錘細胞，4天左右形成克隆。MSC貼壁稀疏時，長梭形細胞的兩極朝向不規律，細胞排列混亂，細胞之間往往通過突起相連接。近3周時出現致密的細胞層，細胞兩極有規律的排列成束狀或旋渦狀。傳代后MSC生長迅速，近10天時細胞即可融合。用流式細胞儀分析了MSC的表面抗原標記。結果顯示，MSC表達CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C，而CD34、CD45、HLA-DR則呈陰性。MSC對K562細胞增殖動力學的影響K562細胞與MSC黏附培養8天后，從細胞生長曲線可以看出

18、，K562黏附培養4天時起細胞增殖與懸浮組比較受到明顯抑制 (P<0.05)（圖1）。FCM檢測懸浮與黏附培養后K562細胞各時相細胞的百分率如附表所示。與懸浮培養相比較，黏附培養后K562細胞G0/G1期細胞增加 (P<0.05)、G2/M期細胞增加 (P<0.01)，S期細胞減少 (P<0.05)。這說明K562細胞與MSC接觸培養后使細胞周期各時相細胞量發生改變，增殖率下降，主要阻滯在G0/ G1期。Table.Cell cycle distribution of K562 cells cultivated in suspension and adhesively

19、 cultivated in contact with MSCs（略）化學藥物對K562細胞存活的影響 不同濃度DNR作用于懸浮培養組和黏附培養組K562細胞，在24小時時細胞的存活情況如圖2。與MSC黏附培養后，細胞存活率提高，在DNR濃度為0.8、1.6  g/ml時明顯降低了K562對DNR的敏感性 (P<0.05)，說明MSC誘導了K562細胞對DNR耐藥的發生。細胞凋亡的變化DNR與K562細胞共培養24小時之后，用FCM檢測K562細胞凋亡率，當DNR濃度分別為0.1、0.4、0.8  g/ml時，黏附組的平均凋亡率分別為4.0%、7.8%和14

20、.5%，而懸浮組的凋亡率分別為5.3%、11.7%和23.8%，在0.8 g/ml時凋亡率有顯著差異 (P<0.05)。分別用0.8 g/ml和1.6 g/ml DNR作用于K562細胞24小時時，DNA凝膠梯度電泳結果見圖4。懸浮培養組在1.6 g/ml時有DNA片段形成，并呈較明顯的凋亡DNA梯形帶。而在同等DNR濃度下，黏附組則未見DNA片段梯形帶形成。這證明與MSC黏附培養能抑制DNR誘導白血病細胞凋亡。MDR1表達的影響K562和K562/ADM分別與MSC黏附培養對MDR1基因表達的影響見圖5。由圖5可見黏附培養后未誘導K562細胞表達MDR1，同時也未使MDR1陽性的K56

21、2/ADM表達發生改變，說明與MSC黏附培養對K562細胞MDR1基因表達未產生影響。討 論骨髓MSC可分化為成纖維細胞、脂肪細胞等一組不均質細胞組成的基質細胞。研究證實，骨髓基質細胞可通過黏附反應來直接調控造血細胞的功能，并對造血系統惡性腫瘤細胞的增殖、分化也起重要作用。HL-60及U937細胞株與正常成人骨髓成纖維樣基質細胞黏附培養后均可導致G1期細胞增多，S期細胞減少，直接抑制白血病細胞增殖，阻斷細胞周期運行4，5。本研究把K562細胞與正常成人骨髓MSC進行黏附培養，細胞增殖受抑，K562細胞除表現處于G0/G1期細胞增多外，還發現S期細胞明顯減少，G2/M期細胞明顯增多，這證明MSC

22、可阻滯細胞周期進程，提示MSC與白血病細胞黏附在白血病耐藥的產生中可能起重要作用。Konlpleva等6報道，當HL-60和NB-4細胞系與鼠MS-5基質細胞共培養時，Ara-C誘導的凋亡減弱，有人把急性淋巴細胞白血病細胞與骨髓基質細胞共培養，發現由Ara-C和Vp16誘導的調亡降低3。除了白血病，Nefedova等7發現當骨髓瘤細胞系黏附于骨髓基質細胞時，骨髓瘤細胞凋亡抑制率超過50%以上。新近Tabe等8報道，骨髓MSC起源的脂肪細胞與早幼粒白血病細胞直接接觸，可降低全反式維甲酸和阿霉素誘導凋亡的作用。本研究結果發現，當K562細胞與MSC黏附培養時，對DNR的敏感性下降，在相同濃度DNR

23、作用下凋亡率下降，這證明了與MSC黏附培養可誘導K562細胞對DNR耐藥的形成。抑制細胞增殖是白血病治療的有效方法，但也是根治該病的重要障礙，因為它使細胞對藥物不敏感，進而促進骨髓微小殘留病（ minimal residual disease，MRD）的產生。骨髓MSC和其分化的基質細胞對白血病細胞周期的調控作用在白血病耐藥的形成中可能起重要作用。    研究發現，與基質細胞黏附共培養誘導白血病細胞增殖受抑、凋亡受阻的機制在不同的細胞系有所不同。 HL-60和NB-4細胞系與鼠MS-5基質細胞共培養時，白血病細胞Bcl-2表達水平升高5，而41整合蛋白陽性的急性髓

24、系白血病細胞與骨髓基質細胞黏附培養后是通過PI-3k/AKT/Bcl-2信號途徑產生耐藥9。這些結果說明，這種細胞間的直接黏附作用對白血病細胞增殖、凋亡的調節機制是復雜的，是由細胞周期和凋亡的多重調控機制和通路完成的。同時，MSC由于能產生多種細胞因子，故還可能通過細胞因子的旁分泌作用或MSC-白血病細胞間反應所誘導產生的細胞因子共同參與作用。另外，為了明確MSC與白血病細胞多藥耐藥的關系，本研究對黏附培養后K562和K562/ADM細胞的MDR1基因表達進行了測定，結果表明黏附培養并未誘導K562細胞表達MDR1，也未使K562/ADM細胞MDR1表達發生改變。  

25、60; 總之，白血病細胞與骨髓MSC直接接觸對AML化療敏感性、骨髓MRD的發展和預后可能起重要影響。 【參考文獻】  1Gibson LF.Survival of B lineage leukemic cells ： signals from the bone marrow microenvironment. Leuk Lumphoma，2002；43：19-272Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell. Science，1999；284（5411）:143-1473Mudry RE，Forthey JE，York T，et al. Stromal cells regulate survi-val of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood，2000；96：1926-19324梁蓉，黃高升，陳協群等.人成纖維樣基質細胞系對HL-60細胞增殖和VEGF表達的影響. 中國實驗血液學雜志，2003；11：476-4795梁蓉，黃高升，王哲等. 正常人骨髓成纖維樣基質