1、細胞治療實驗室工藝流程細胞治療實驗室工藝流程按種類分為：一、試劑耗材入庫記錄，試劑耗材使用記錄，試劑配制記錄，配制的試劑使用記錄。入庫需要記錄產(chǎn)品的名稱、批號、有效期、數(shù)量、存放位置、入庫時間。試劑耗材使用記錄包括名稱、批號、用途，時間。試劑配制記錄包括原料的名稱、批號，配制試劑的時間、有效期、批號。配制的試劑使用記錄包括使用的時間、批號、用途。二、實驗記錄，包括采血、分血、細胞接種、補液、質(zhì)檢、回輸。采血有 2 個信息實驗室需要記錄，包括濃縮白細胞體積和血漿體積。分血有需要記錄使用的分離液的量和單個核細胞數(shù)量。細胞接種需要記錄DC、 CIK、 CD3AK、 T、NK 等細胞接種數(shù)量、培養(yǎng)基體

2、積、細胞因子添加的量。補液需要記錄補液的時間和體積。質(zhì)檢需要做細菌真菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素檢測、革蘭氏檢測，記錄做這些質(zhì)檢的時間。回輸需要記錄回輸?shù)募毎N類、時間、細胞體積、細胞數(shù)量。三、細胞檢測記錄，包括細菌真菌培養(yǎng)，內(nèi)毒素檢測，革蘭氏檢測，流式檢測。記錄內(nèi)容包括樣品的來源、檢測時間、結(jié)果、檢測人。四、清洗消毒記錄。包括清洗消毒的時間、方式、消毒有效期。DC細胞2 小時后洗版第5天加成熟劑 1第6天加成熟劑 2第7天收細胞，計算細胞存活率、細胞數(shù)后凍存或回輸CIK細胞第 2天加CIK 混合因子根據(jù)細胞生長情況補液回輸前3天細菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時革蘭氏染色計算細胞存活率、細胞數(shù)后給病人回輸細胞培養(yǎng)

3、流程圖采血分血細胞計數(shù)細胞接種CD3AK細胞T細胞NK 細胞其它細胞根據(jù)細胞根據(jù)細胞根據(jù)細胞生長情況生長情況生長情況補液補液補液回輸前 3回輸前 3回輸前 3天細菌真天細菌真天細菌真菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)回輸前12回輸前12回輸前12小時革蘭小時革蘭小時革蘭氏染色氏染色氏染色計算細胞計算細胞計算細胞存活率、細存活率、細存活率、細胞數(shù)后給胞數(shù)后給胞數(shù)后給病人回輸病人回輸病人回輸NO：_自體細胞制劑制備記錄患者基本情況采血日期：姓名年 齡性別科室病案號主管醫(yī)生床號傳染病臨床診斷病理切片細胞制備標準操作記錄分血數(shù)量單位日期操作人復核人備注自體血漿體積ml白細胞體積mlFicol 體積ml批號：PBMC

4、總量9× 10DC細胞制備數(shù)量單位日期操作人復核人備注1、 PBMC 用量8× 102、鋪瓶（板）瓶（板）3、加 DC 培養(yǎng)液體積ml4、 DC誘導因子（ 100X）ml批號：5、第五天加 DC成熟劑 1（ 100X）ml批號：6、 第六天補加 DC成熟劑 2（ 100X）ml批號：7、第七（八）天收集 DC7× 10CIK細胞制備數(shù)量單位日期操作人復核人備注1、添加 IFN-rIU2、 PBMC 用量8× 103、接種體積ml4、添加 CIK 混合因子（ 100X）ml批號：第 1 次第 2 次第 3 次ml5、補液第 4 次第 5 次第 6 次CD3

5、AK 細胞制備數(shù)量單位日期操作人復核人備注1、添加 CD3AK 混合因子批號：（ 100X）ml2、 PBMC 用量8× 103、接種體積ml第 1 次第 2 次4、補液第 3 次ml第 4 次第 5 次T細胞制備數(shù)量單位日期操作人復核人備注1、 PBMC 用量9× 102、接種體積ml3 、添加T混合因子批號：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、補液第 3 次ml第 4 次第 5 次NK 細胞制備數(shù)量單位日期操作人復核人備注1、 PBMC 用量8× 102、接種體積ml3、添加 NK 細胞混合因子批號：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、補液第 3

6、次ml第 4 次第 5 次細胞凍存及復蘇標準操作記錄細胞凍存標準操作記錄日期細胞細胞凍存數(shù)量凍存液存放復核人備注編號數(shù)量（支）編號操作人類型位置細胞復蘇標準操作記錄日期細胞細胞復蘇數(shù)量復蘇存放復核人備注編號數(shù)量（支）用途操作人類型位置自體細胞制劑回輸記錄姓名年齡性別科室病案號床號次數(shù)日期細胞類型批號體積（ ml）回輸方式運送人接收人復核人123456789101112131415161718自體細胞制劑檢控記錄次數(shù)細胞外觀細菌真菌革蘭氏染色細菌內(nèi)毒素最終檢定結(jié)果存活率數(shù)量操作人復核人培養(yǎng)回輸細胞批均勻懸濁液，無第一次回輸前 3每次回輸當天每次回輸當天需經(jīng)檢定合格后存活率號異物天方可回輸 85%

7、1是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格2是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格3是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格4是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格5是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格6是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格7是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格8是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格9是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格10是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格11是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格12是 否陽性陰性陽性陰性陽性 陰性合格不合格13是 否陽性陰性陽性陰性陽性陰性合格不合格CIK 細胞培養(yǎng)標準操

8、作流程一、溶液的配置1、 熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi)，放入40 分鐘，取出用2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、 IFN-r 母液（ 1000X）：用無血清培養(yǎng)基配成100 萬 IU/ml 。3、 CIK混合因子 (100X)：冰箱 4 度保存。56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活4、CIK完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基加1%-2%熱滅活自體血漿。二、CIK細胞制備：1、 血細胞單采機采集病人濃縮白細胞和血漿（80-100ml）。2、 準備 2 支 50ml 離心管，每管加入淋巴細胞分離液20ml。3、 將濃縮白細胞從血袋中取出， 直接等量加到上述2 支 50ml 離心管淋

9、巴細胞分離液上面， 2000轉(zhuǎn)離心 25 分鐘，升降速調(diào)到最低值。4、 取出上層的血漿收集到一支50ml 離心管中，余下的部分除紅細胞外全部收集到2 支 50ml 離心管中，加生理鹽水到50ml，1500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，去除上清，合并2 支管內(nèi)的細胞到一支50ml 離心管中，加 50ml 生理鹽水，取 20ul 樣品用于計數(shù)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清。5、 所有的血漿留出 12 支 5ml 用于回輸，其余全部56 攝氏度滅活 40 分鐘，滅活完成后2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，收集上清備用。6、 將細胞用 CIK完全培養(yǎng)基配成1X106/ml ，加入 IFN-r 母液至 1

10、000IU/ml ，接種 1 個細胞培養(yǎng)袋，袋內(nèi)加 200ml CIK完全培養(yǎng)基。7、 24 小時后，按 1:100 加入 CIK混合因子。8、 第 5 天，按 4 倍稀釋添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培養(yǎng)基。9、 第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培養(yǎng)基。同時取樣做細菌真菌培養(yǎng)。10、以后每隔一天按2 倍稀釋補一次液，第一次回輸前1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。11、等拿到細菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后， 檢查所有結(jié)果是否為陰性。 CIK培養(yǎng)到第 10 天 -15 天內(nèi)回輸。12、回輸時收集細胞于離心管內(nèi)，1200 轉(zhuǎn)離心 7 分

11、鐘，去除上清，收集細胞后加生理鹽水再離心 2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。13、將收集到的細胞加入到150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿， 2 萬 IU IL-2，留1ml 細胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。14、 將完成的細胞懸液封好瓶口，核對病人姓名、性別、年齡、住院號、細胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項目，確認無誤后，貼上標簽，送病區(qū)進行回輸。DC 細胞培養(yǎng)標準操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、DC基礎(chǔ)培

12、養(yǎng)基：用無血清培養(yǎng)基+2%熱滅活自體血漿。3、DC誘導劑 (100X）：冰箱 4 度保存。4、DC培養(yǎng)基： DC基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入DC 誘導劑4、DC成熟劑 1(100X）：冰箱 4 度保存。5、DC成熟劑 2（100X）：冰箱 4 度保存。二、DC細胞制備：6養(yǎng)箱。2、 2 小時后，取出，晃動去除上層雜細胞，留下貼壁的單核細胞（體積比其它細胞稍大），每孔加入 3ml DC 培養(yǎng)基。3、 第 5 天，按每孔 30ul 加入 DC成熟劑 1，取樣做細菌、真菌培養(yǎng)。4、 收集細胞前 12 小時每孔加入 30ul DC成熟劑 2，同時取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、 DC培養(yǎng)到第 7-8 天，收集細胞，用

13、生理鹽水洗3 次，分成 4 份，其中一份用于當天回輸，其余凍存在 -80 度冰箱中。6、 將生理鹽水清洗過的DC 細胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿，留1ml細胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。7、 將完成的細胞懸液封好瓶口，核對病人姓名、性別、年齡、住院號、細胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項目，確認無誤后，貼上標簽，送病區(qū)進行回輸。CD3AK細胞培養(yǎng)標準操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活 40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、CD3AK混

14、合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、CD3AK完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基+1%-2%熱滅活自體血漿 + CD3AK混合因子。二、CD3AK細胞制備：1X106/ml ，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。1、PBMC用 CD3AK完全培養(yǎng)基配成2、第 5 天，按 4 倍稀釋添加 CD3AK完全培養(yǎng)基。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加 CD3AK完全培養(yǎng)基。同時取樣做細菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰性。CD3AK培養(yǎng)到第 10 天 -15 天內(nèi)回輸。6、回輸時收集細胞于離

15、心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細胞后加生理鹽水再離心 2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿， 2 萬 IU IL-2，留1ml 細胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。8、將完成的細胞懸液封好瓶口，核對病人姓名、性別、年齡、住院號、細胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項目，確認無誤后，貼上標簽，送病區(qū)進行回輸。 T 細胞培養(yǎng)標準操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活 40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10

16、分鐘，取出上清備用。2、 T 混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基 1%-2%熱滅活自體血漿。二、 T 細胞制備：1、將 PBMC用完全培養(yǎng)基配成 2X106/ml ，加入混合因子，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。2、第5天，按 2倍稀釋添加含 400IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。3、第8天到第 9天，按 2 倍稀釋添加含 400IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。 同時取樣做細菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰性。T 培養(yǎng)到第 10 天 -15 天

17、內(nèi)回輸。6、回輸時收集細胞于離心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細胞后加生理鹽水再離心2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細胞加入到150ml 注射用生理鹽水中，加入 5ml 自體血漿，留 1ml 細胞懸液到 1.5ml離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。8、將完成的細胞懸液封好瓶口，核對病人姓名、性別、年齡、住院號、細胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項目，確認無誤后，貼上標簽，送病區(qū)進行回輸。NK 細胞培養(yǎng)標準操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10

18、分鐘，取出上清備用。2、NK 細胞混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培養(yǎng)基： SCGM無血清培養(yǎng)基 +1%-2%熱滅活自體血漿。二、 NK 細胞制備：1、將 PBMC用完全培養(yǎng)基配成 1X106/ml ，加入 NK 細胞混合因子，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。2、第 5 天，添加 2 倍量完全培養(yǎng)基，加入 500IU/ml IL-2。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加含 500IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。 同時取樣做細菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰性。NK 培養(yǎng)到第 10 天-15 天內(nèi)回輸。6、回輸時收集細胞于離心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細胞后加生理鹽水再離心2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入 5ml 自體血漿，留 1ml 細胞懸液到