1、CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1在喉癌癌變過程中表達及其臨床病理意義摘要目的探討喉癌癌變過程中CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1表達的臨床病理學意義。方法用免疫組化檢測20例正常粘膜、40例不典型增生病變和60例喉癌組織中CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1的表達。結果CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1陽性表達定位于細胞核。在喉癌癌變過程中，喉正常粘膜、不典型增生病變和喉癌中CyclinE陽性表達率分別為：5.0%(1/20)，20.0%(8/40)，45.0%(27/60) (P0.001)；Cy

2、clinD1陽性表達率分別為：5.0%(1/20)，30.0%(12/40)，53.3%(32/60)( P0.001)；P21WAFI/CIP1陽性表達率分別為：95.0%(19/20)，75.0%(30/40)和63.3%(38/60) (P0.05)。P21WAFI/CIP1在高、中和低分化的喉癌中陽性表達率分別為：76.2%(16/21)，65.5%(19/29)和30.0%(3/10) (P0.05)；CyclinE、CyclinD1陽性表達與腫瘤細胞的分化無關。CyclinD1和P21WAFI/CIP1陽性表達顯著相關，CyclinE與CyclinD1，CyclinE與P21WAF

3、I/CIP1表達無相關性。結論喉癌癌變過程中CyclinE和CyclinD1陽性表達率呈逐漸升高的趨勢，而P21WAFI/CIP1陽性表達率呈逐漸降低的趨勢。CyclinE和CyclinD1異常表達是喉癌發生中早期分子事件。P21WAFI/CIP1表達與喉癌細胞分化程度有關。細胞周期調控因子CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1相互調控機制在喉癌發展中起重要作用。關鍵詞喉癌；細胞周期蛋白E；細胞周期蛋白D1；P21WAFI/CIP1基因；免疫組織化學中分類號文獻標識碼A Clinicopathological significance of CyclinE、CyclinD1

4、 P21WAFI/CIP1 experssion in laryngeal carcinogenesisWANG Jian-bo，LOU Wei-hua，DONG Ming-min(Department of Otorhinolarygology,Jining First Peoples Hospital,Jining 272111)AbstractObjectiveTo investigate the clinicopathlogical significance of the CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 expression in laryngeal

5、 carcinogenesis.MethodsThe expression of CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 was examined by immunohistochemistry method in 20 cases of nomal epithlium,40 cases of dysplastic epithlium and 60 cases of laryngeal cancers.ResultsImmunoreaction of CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 was localized in the nuc

6、lei of cells.In normal epithlium,dysplastic squamous epithlium and squamous cell carcinoma of the larynx,the positive immunostaining rate of Cycline protein was 5.0%(1/20),20.0%(8/40) and 45.0%(27/60) respectively (p0.001) ,of CyclinD1 protein was 5.0%(1/20),30.0%(12/40) and 53.0%(32/60) respectivel

7、y (P0.001) and of P21WAFI/CIP1 protein was 95.0%(19/20),75.0%(30/40) and 63.3%(38/60) respectively(P0.05).P21WAFI/CIP1 positive expression in highly、moderately and poorly differtiated carcinomas were 76.2%(16/21)、66.5%(19/29) and 30.0%(3/10) respectively(P0.05),P21WAFI/CIP1 protein expression was si

8、gnificantly associated with tumour cell differentiation.The positive expression of CyclinD1 closely related to the positive expression of P21WAFI/CIP1(P0.05).ConclusionsWith the development of lesions,the positive immunostaining rate of CyclinE and CyclinD1 protein increased,while the rate of P21WAF

9、I/CIP1WAFI/CIP1 expression was associated with tumour cell differentiation.The cell cycle regulators play an important role in the laryngeal carcinoma.Key wordslaryngeal neoplasms;CyclinE gene;CyclinD1 gene;P21WAFI/CIP1 gene;immnuohistochemistry喉癌如同所有腫瘤性疾病一樣，其上皮細胞癌變機制不明。研究證實：細胞周期調控異常是腫瘤發生的內在原因，在細胞周期

10、中，G1/S的調控點是細胞內外信號經過傳遞、整合匯集到細胞核，對細胞的增殖進行調控的關鍵點，該點調控的異常與腫瘤的發生發展關系密切1。CyclinE和CyclinD1是G1/S轉換的正性調控因子，P21WAFI/CIP1是負性調控因子。同時觀察CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1基因蛋白產物在喉癌癌變過程中的表達國內外尚未見報道。本研究以喉正常粘膜，喉粘膜不典型增生病變和喉癌為研究對象，采用免疫組化方法檢測兩種基因蛋白產物，觀察在喉癌癌變過程中變化及相互關系，為進一步研究喉癌發生發展分子學基礎提供有價值資料。材料和方法材料60例喉癌標本，喉粘膜不典型增生病變組40例，20

11、例正常粘膜。臨床資料60例喉癌組，男性55例，女性5例，年齡4778歲(平均58歲)；按1992年UICC分型分期：聲門上型18例，聲門型31例，聲門下型11例；T分期：T1 6例，T2 12例，T3 29例，T4 13例；臨床分期：期5例，期7例，期37例，期11例。病理檢查均為鱗狀細胞癌，其中高分化21例，中分化29例，低分化10例。方法免疫組化染色采用SP法，鼠抗人SP試劑盒，兔抗人CyclinE(HE-12)鼠抗人單克隆抗體、CyclinD1(HD-11)單克隆抗體和鼠抗人P21WAFI/CIP1(4D-10)單克隆抗體均為Santa Cruz公司產品，購于北京中山生物技術有限公司。D

12、AB顯色濃縮液購于鄭州華美公司。免疫組化染色按SP法試劑盒提供說明進行，免疫組化檢測設陽、陰性和空白對照。用SAS統計軟件包進行統計分析。結果判定標準參考文獻2，3，4確定本實驗結果判斷標準：CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1陽性反應物均為棕黃色顆粒，定位于細胞核。以細胞核中出現棕黃色顆粒作為陽性細胞，根據陽性細胞數判斷結果：陰性(-)：無陽性細胞或陽性細胞數5%，染色強度較淺；陽性(+)：陽性細胞數5%，染色強度中等以上。結果三種基因陽性細胞的表達三種基因蛋白產物陽性反應物均呈棕黃色顆粒。CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1陽性表達以細胞核為主。

13、正常喉粘膜中CyclinE和CyclinD1各有一例表達陽性，染色較弱；P21WAFI/CIP1陽性細胞出現在上皮的中層，基底膜和表層細胞表達陰性。在喉不典型增生病變中，CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1陽性細胞出現在上皮的中下層。喉癌中，CyclinD1陽性表達呈彌漫性分布，CyclinE和P21WAFI/CIP1陽性細胞呈散在分布。三種基因蛋白產物在喉癌癌變中的表達由表1可知：CyclinE和CyclinD1在喉正常粘膜、喉不典型增生病變和喉癌中陽性表達率呈逐漸升高的趨勢，喉癌組明顯高于對照組，組間比較有高度顯著性差異(P均0.01)。P21WAFI/CIP1在喉癌

14、癌變過程中，陽性表達率呈逐漸降低的趨勢，喉癌組明顯低于對照組，組間比較有顯著性差異(P0.05)。三種基因陽性表達與臨床病理參數關系由表2可知：P21WAFI/CIP1在高、中和低分化的喉癌中陽性表達率呈逐漸下降的趨勢，高分化組明顯高于底分化組，組間比較有顯著性差異(P0.05)。CyclinE、CyclinD1和 P21WAFI/CIP1陽性表達率與喉癌的性別，臨床分型，T分型和臨床分期無顯著性差異(P均0.05)。三種基因陽性表達相關性分析由表3和4可知： 喉癌中 CyclinD1 和 P21WAFI/CIP1陽性表達顯著相關(P0.05)。表1三種基因蛋白在喉癌癌變過程中的表達組織類型C

15、yclinE例(%)aP21WAFI/CIP1例(%)bCyclinD1例(%)c-+-+-+正常組191(5.0)119(95.0)191(5.0)不典型增生組328(20.0)1030(75.0)2812(30.0)喉癌組3327(45.0)2238(63.3)2832(53.3)a,x2=14.29,P0.001;b,x2=8.77,P0.05;c,x2=16.39,P0.001 表2喉癌中三種基因蛋白產物表達與臨床病理參數的關系臨床病理參數例數CyclinE例(%)aP21WAFI/CIP1例(%)bCyclinD1例(%)c-+-+-+性別男553025(45.5)3025(45.5

16、)2629(52.7)女532(40.0)23(60.0)23(60.0)分化高分化211110(47.6)516(76.2)a1011(52.4)程度中分化291514(48.3)1019(65.0)1415(51.7)低分化1073(30.0)73(30.0)46(60.0)臨床聲門上型18108(44.4)810(55.6)99(50.0)分型聲門型311912(38.7)1120(64.5)1615(48.4)聲門下型1147(63.6)38(72.7)38(72.7)T分期T1-218117(38.9)99(50.0)117(38.9)T3-4422220(47.6)1319(69.

17、1)1725(59.5)臨床-1284(33.3)57(58.3)75(41.7)分期-482523(47.9)1731(64.6)2127(64.6)a2=6.34P0.05 表3喉癌中Cyclin D1與P21WAFI/CIP1、Cyclin E表達的相關性CyclinD1P21WAFI/CIP1例(%)aCyclinE例(%)b-+-+陽性組8241616陰性組14141117a 2=4.02P0.05 討論一、CyclinE和CyclinD1基因蛋白表達與喉癌發生發展的關系CyclinE和CyclinD1是參與細胞周期G1/S轉換的重要正性調節因子。它們過度表達使細胞周期G1/S轉換時

18、間縮短，進而促進細胞周期的進程和細胞過度增殖，導致細胞癌變。研究表明：免疫組化法檢測CyclinE和CyclinD1蛋白表達可以反映其基因的擴增和mRNA過表達的水平4，5。因此，通過免疫組化法探討喉癌發生發展的不同階段(正常不典型增生病變原發性腫瘤)，可有助理解CyclinE和CyclinD1在喉癌發生發展中的作用。本實驗發現：喉癌癌變過程中CyclinE和CyclinD1陽性表達率呈逐漸升高的趨勢，喉癌組明顯高于對照組；CyclinE和CyclinD1蛋白表達不僅出現在腫瘤細胞，而且在不同程度的不典型增生病變中也有表達，并且CyclinE和CyclinD1陽性表達與喉癌細胞分化程度、臨床分

19、型、T分期和臨床分期無相關性；說明CyclinE和CyclinD1的陽性表達在一部分喉癌的發生過程中起重要作用。結果表明CyclinE和CyclinD1基因蛋白的表達可能是喉癌發生過程中一個較早的分子事件。與文獻2，4報道一致。有學者在乳腺癌4，6、食管癌7和胃癌8中均發現CyclinE和CyclinD1基因的擴增出現在細胞癌變的早期，這就意味著CyclinE和CyclinD1基因有可能成為潛在的腫瘤診斷標志。在多種腫瘤中，CyclinE和CyclinD1過度表達的陽性率與其基因擴增率并不一致，Gausauge等9報道28例胰腺癌中25%存在DNA的擴增，mRNA的過度表達高達82%，Cycl

20、inD1蛋白表達率為64%。大腸癌中未發現明顯的CyclinD1基因擴增，而CyclinD1陽性表達率為20%10；Akama8在胃癌研究中發現CyclinE基因擴增率約為15%，CyclinE蛋白陽性表達率為60%；卵巢癌中CyclinE基因擴增率為21%，mRNA過度表達率為29.5%11。結果表明CyclinE和CyclinD1基因擴增可導致其蛋白的過度表達，但不是其陽性表達的唯一機制，也可能存在轉錄后機制和翻譯水平修飾。不論CyclinE和CyclinD1表達的機制如何，腫瘤中陽性表達具有惡性轉化的潛力。本研究結果表明，CyclinE和CyclinD1異常表達在喉癌發生發展中可能起重要

21、作用。二、P21WAFI/CIP1陽性表達與喉癌癌變的關系P21WAFI/CIP1基因的生物學作用是直接參與細胞生長抑制、DNA復制、發育和分化等調控過程，與腫瘤的發生發展機制密切相關1。本實驗中，P21WAFI/CIP1基因蛋白陽性表達率在喉癌癌變過程中呈逐漸降低的趨勢，喉癌組明顯低于對照組(P0.05)。由于P21WAFI/CIP1是一種至今罕見突變的腫瘤抑制基因，可認為免疫組化檢出的P21WAFI/CIP1均有生物學功能，本實驗結果提示P21WAFI/CIP1基因在喉癌癌變過程中，逐漸失去抑制細胞增殖，促進細胞分化功能，其蛋白表達水平的降低參與喉癌的發生。實驗表明，P21WAFI/CIP

22、1陽性表達與腫瘤細胞分化有關1，3。本實驗發現喉癌中，高、中和低分化組P21WAFI/CIP1陽性表達率隨分化程度降低呈下降趨勢，高分化組明顯高于低分化組(P0.05)。表明P21WAFI/CIP1陽性表達與喉癌細胞分化程度有關，P21WAFI/CIP1能誘導喉癌中特異性基因表達，對于促進喉癌細胞分化，抑制細胞增殖起重要作用，與文獻1，3結果一致。三、喉癌中三種基因陽性表達的相關性研究表明：DNA損傷因子導致P53表達增高，通過誘導其下游靶基因P21WAFI/CIP1的表達，抑制CyclinD1-CDK4/6復合物活性，反饋誘導CyclinD1的表達12。本實驗發現CyclinD1與P21WA

23、FI/CIP1表達顯著相關。說明：在喉癌發生發展過程中可能存在因P21WAFI/CIP1誘導CyclinD1表達途徑，提示喉癌中CyclinD1陽性表達，除基因擴增外，P21WAFI/CIP1誘導途徑也可能是其表達的重要機制之一。與在乳腺癌13的研究結果一致。本實驗發現在喉癌發展中CyclinE和CyclinD1表達無相關性，與在卵巢癌11的研究一致；分析認為：CyclinE和CyclinD1同為G1期周期蛋白，CyclinE合成晚于CyclinD1，它們與其聯手激活的CDK不同，CyclinD1與CDK4/6結合，CyclinE與CDK2結合。因此，它們可能通過不同作用途徑調控細胞周期進程。

24、總之，在喉癌發展中細胞周期調控因子相互調控機制在喉癌演進過程中起重要作用。作者簡介：王建波(1966-)，男，山東汶上人，碩士，主治醫師。從事耳鼻咽喉專業。王建波(濟寧市第一人民醫院耳鼻喉科山東濟寧 272111)韓月臣(濟寧市第一人民醫院耳鼻喉科山東濟寧 272111)婁衛華(河南醫科大學第一附屬醫院)董明敏(河南醫科大學第一附屬醫院)參考文獻1，Sherr CJ and Roberts JM.Inhibitors of mammalina G1 cyclindependent kinase.Genes Develop,1995;9:1149-11632，Fracchiolla SN,Pru

25、neri G,Pignataro L,et al.Molecular and immunohistochemical analysis of the bcl-1/cyclinD1 gene in laryngeal squamous.Cancer,1997;79:1114-1121WAFI/CIP1 expression is associated with cell differentition but not with p53 mutations in squamous cell carcinomas of larynx.J Pathol,1997;183;156-1634，ScottKA

26、,Walker RA.Lack of cyclinE immunoreactivity in nonmalignant breast and association with proliferation in breast cancer.Br J Cancer,1997;76(10):1288-12925，Capaccio P,Pruneri G,Carboni N.CyclinD1 protein expression is related to clinical progression in laryngeal squamous cell carcinomas.J Laryngol and Otol,1997;11:622-6266，Bartkova J,Lukas J,Strans M,et al.Cell cycle-related variation and tissue-restricted expression of human cyclinD1 protein.J Pathol,1994;172:237-2457，鄭杰，候萍，周傳農等.CDKN2 (P16INK4/MTS1)基因丟失和CyclinD1擴增在食管癌發生中的意義，中華腫瘤雜志，1996;18：408-4118，Akama Y,Yasui W,