1、    人補(bǔ)體膜輔助調(diào)節(jié)蛋白MCP的基因克隆 及其真核表達(dá)的研究        【摘要】目的克隆獲得編碼人補(bǔ)體膜輔助調(diào)節(jié)蛋白(MCP)的cDNA，并對(duì)其在真核細(xì)胞的表達(dá)及功能進(jìn)行研究。方法應(yīng)用RT-PCR方法,從U937細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增編碼人MCP分子的cDNA片段,快速克隆于pGEM-T Easy載體，測(cè)定其序列。將該片段重組于pLXSN載體，電穿孔轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)FACS檢測(cè)篩選表達(dá)MCP的陽(yáng)性細(xì)胞克隆,用補(bǔ)體溶破試驗(yàn)鑒定其抑制人補(bǔ)體溶破的功能。結(jié)果R

2、T-PCR擴(kuò)增得到1144bp的編碼人MCP分子的cDNA片段，序列分析表明該cDNA編碼的蛋白為STC+CYT2亞型。細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩選獲得多個(gè)表達(dá)MCP的NIH3T3陽(yáng)性細(xì)胞克隆,補(bǔ)體溶破試驗(yàn)證實(shí)其具有抑制人補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑溶破的功能。結(jié)論本研究為進(jìn)一步探討不同亞型結(jié)構(gòu)的MCP分子與功能的關(guān)系及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。【主題詞】補(bǔ)體膜輔助調(diào)節(jié)蛋白補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因克隆基因表達(dá) Molecular cloning and expression of human complement membrane cofactor proteinBAI Yun*, JIAN Man, WANG Gengyin，e

3、t al.*Department of Immunology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038【Abstract】ObjectiveHuman membrane cofactor protein (MCP,CD46) is a cell surface glycoprotein acting as a cofactor for the factor I-mediated inactivation of C3b and C4b, which is also a receptor for measles virus (

4、MV). MCP exists in several isoforms which are variably expressed in different human tissues. These isoforms differ in their cytoplasmic and transmembrane regions and in a portion of their proximal extracytoplasmic region. The purpose of this study is to obtaine the cDNA sequence encoding human MCP,

5、and express it on xenotypic cells for further studying. MethodscDNA fragment was amplified with RT-PCR method. The fragment was cloned into pGEM-T Easy plasmid, and further sequenced using Dye Terminator Cycle Sequencing Kit with AmpliTaq DNA Polymerase by ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer. Furthermore,

6、 the cDNA of MCP was transfected into NIH3T3 cells using the pLXSN retroviral vector. ResultsThe cDNA fragment we have cloned from U937 cells including 1144bp open reading region ,which encoded the signal peptide, four extracellular short consensus repeat domains (SCRs), a Ser/Thr (STC)-rich region,

7、 a transmembrane region and a cytoplasmic tail(CYT2).Its sequence was identical to the published sequence encoding STC/CYT2 isoform of human MCP. When it expressed on the mouse NIH3T3 cells surface stably, the transfected cells were resistant to human complement-mediated cell killing. ConclusionThe

8、results suggest that the gene for MCP can be expressed in xenotypic cells to confer protection against human serum complement.【Subject words】Membrane cofactor proteinComplement regulatory proteinsMolecular cloningGene expression補(bǔ)體膜輔助調(diào)節(jié)蛋白（membrane cofactor protein，MCP，CD46）是跨膜型細(xì)胞表面糖蛋白，具有廣泛的細(xì)胞及組織分布，屬于

9、補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)因子基因簇（regulator of complement activation gene cluster，RCA）的成員。其蛋白分子含有4個(gè)SCRs結(jié)構(gòu)，有多種變異型，不同變異型的組織細(xì)胞分布及功能有所差異1，2。MCP的主要功能是輔助I因子降解C3b 和C4b，它與CR1、CD55和CD59一起有效地控制補(bǔ)體的活化，保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷3。近年的研究還揭示了MCP是麻疹病毒（measles virus，MV）的受體，與MV感染及感染后引起的免疫抑制密切相關(guān)4，5。此外，MCP分子在生殖免疫6、微生物及腫瘤的免疫逃避、異種器官移植超急排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病等方面都具有

10、重要的意義7；并且在MV感染的治療、超急排斥反應(yīng)的控制及多種免疫性疾病的治療方面顯示了良好的應(yīng)用前景8。本研究應(yīng)用RT-PCR方法,從U937細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到編碼人STC+CYT2亞型MCP分子的cDNA序列，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染獲得表達(dá)MCP的小鼠NIH3T3細(xì)胞克隆,并初步探討了其對(duì)人補(bǔ)體溶破的抑制功能。為進(jìn)一步研究不同變異型MCP分子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、探討其病理生理意義奠定了基礎(chǔ)。材料與方法主要試劑：質(zhì)粒載體pGEM-T Easy購(gòu)自Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN為本室保存；TitanTM One Tube RT-PCR試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司；限

11、制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自華美公司；anti-MCP單抗購(gòu)自Serotec公司。引物設(shè)計(jì)和合成：設(shè)計(jì)合成了一對(duì)分別位于編碼MCP分子cDNA序列的上下兩側(cè)引物，中間包含了包括34aa信號(hào)肽在內(nèi)的完整的MCP編碼序列。PCR引物由上海細(xì)胞研究所合成。Primer1:5-GCGGAGAAATAACAGCGTCTTCCG-3；Primer2:5-CGCTATTCAGCCTCTCTGCTCTGC-3。細(xì)胞總RNA的提取：采用MCP高表達(dá)的U937細(xì)胞系，參照異硫氰酸胍一步法提取總RNA，提取物于1.5%的瓊脂糖凝膠上行甲醛變性電泳。RT-PCR擴(kuò)增：參照TitanTM One Tube RT-PCR

12、System說(shuō)明書(shū)并加以改進(jìn)，以反義引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。取8l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果。擴(kuò)增片段以Stu、BamH酶切鑒定。擴(kuò)增片段的基因克隆和序列分析：將PCR產(chǎn)物純化回收后，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化入E.coli JM109后經(jīng)氨芐青霉素及-互補(bǔ)篩選，用EcoR酶切鑒定，得到含有目的基因片段的重組質(zhì)粒。DNA序列分析由上海公司進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序操作。重組表達(dá)質(zhì)粒pL-MCP的構(gòu)建：按2的方案進(jìn)行，DNA重組技術(shù)如DNA片段的回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等均參照文獻(xiàn)方法。基因轉(zhuǎn)染：按文獻(xiàn)的方法，用電穿孔法將pL-MCP質(zhì)粒導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，同時(shí)導(dǎo)入pLXSN空載體對(duì)照；G

13、418加壓篩選重組細(xì)胞克隆。FACS檢測(cè)重組細(xì)胞MCP的表達(dá)：隨機(jī)挑選pL-MCP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞5株，調(diào)整為105/ml，用anti-MCP McAb進(jìn)行免疫熒光染色。補(bǔ)體殺傷實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染pL-MCP的陽(yáng)性NIH3T3細(xì)胞及pLXSN空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞用PBS調(diào)整為105/ml，每孔加100l。新鮮正常人血清（NHS）用PBS進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)靠?00l，37作用60分鐘。加入MTT（5mg/ml）20l/孔，37作用4小時(shí)，離心棄上清，每孔加入DMSO 150l，室溫5分鐘后測(cè)定其A570值。每個(gè)樣品均做3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果1.U937細(xì)胞總RNA的提取：MCP廣泛分布于人體各組織細(xì)胞表面，但

14、在不同的組織細(xì)胞的表達(dá)有所差異。我們選擇高表達(dá)的U937細(xì)胞為原材料抽提總RNA，電泳結(jié)果顯示不同批次抽提的RNA 28S、18S、5S三帶明顯，且28S>18S。紫外測(cè)定表明A260/A280>1.8，說(shuō)明抽提的總RNA完整，且純度符合反轉(zhuǎn)錄要求。2.RT-PCR擴(kuò)增：獲得1144bp的單一片段。用Stu酶切PCR擴(kuò)增片段后得到258bp和886bp片段，BamH酶切后得到519bp，345bp和280bp三個(gè)片段，符合已知的MCP cDNA片段的限制性酶切譜，初步證明擴(kuò)增得到的1144bp片段是MCP的cDNA(1)。1PCR產(chǎn)物及其酶切鑒定譜Fig 1. Digestion

15、map of PCR productsLane 1：DNA/EcoR+Hind,Lane 2： PCR product digested with BamH, Lane 3： PCR products digested with Stu，Lane 4：PCR products 3.擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆：擴(kuò)增的MCP cDNA與質(zhì)粒pGEM-T Easy連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性及-互補(bǔ)篩選后，用EcoR酶切鑒定，陽(yáng)性重組子可切出1144bp的片段，說(shuō)明cDNA已克隆于載體中，命名為pGEM-MCP。4.克隆片段的DNA序列分析：pGEM-T Easy是可以直接測(cè)序的載體，因此我們以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行測(cè)序

16、，得到了克隆片段的DNA序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，與已知的包括34aa信號(hào)肽序列的STC+CYT2型MCP cDNA序列一致，表明我們已經(jīng)克隆了人MCP cDNA的全部編碼序列。5.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL-MCP的構(gòu)建：重組質(zhì)粒構(gòu)建示意如2，用EcoR從pGEM-MCP質(zhì)粒上切下1144bp的MCP cDNA片段，克隆進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN之中，以小量快速抽提質(zhì)粒法選取重組質(zhì)粒。為了確定插入片段的方向，用Stu酶切鑒定，如3所示。選擇出正向連接的重組克隆，命名為pL-MCP。2重組質(zhì)粒pL-MCP的構(gòu)建Fig 2. Construction of recombinant pL-MCP3重組質(zhì)粒

17、pL-MCP的酶切譜Fig 3.Digestion map of pL-MCPLane 1： DNA/EcoR+Hind，Lane 2： pL-MCP digested with EcoR，Lane 3： pL-MCP digested with Stu，Lane 4： pL-MCP digested with Stu6.pL-MCP轉(zhuǎn)染細(xì)胞及MCP表達(dá)鑒定：將pLXSN和pL-MCP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞隨機(jī)挑選G418抗性克隆數(shù)個(gè)，用anti-MCP單抗染色后，F(xiàn)ACS檢測(cè)其MCP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示多株克隆均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)率為43%62%。選取高表達(dá)克隆擴(kuò)增傳代，命名為3T3/M

18、CP（4）。4FACS測(cè)定重組3T3細(xì)胞MCP的表達(dá)Fig 4. Expression of MCP on NIH3T3 cells7. 3T3/MCP對(duì)人補(bǔ)體的抑制作用：小鼠NIH3T3細(xì)胞能夠激活人補(bǔ)體旁路途徑，如5所示，表達(dá)MCP的陽(yáng)性細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體溶破的抑制作用明顯。53T3/MCP對(duì)人補(bǔ)體的抑制作用Fig 5. Inhibition of human complement lysis on 3T3/MCP cells討論MCP的組織分布廣泛，表達(dá)于除紅細(xì)胞之外的所有造血干細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、表皮和內(nèi)皮細(xì)胞系及神經(jīng)系統(tǒng)的星狀膠質(zhì)細(xì)胞9，但在不同類(lèi)型的細(xì)胞表達(dá)量有所不同。在細(xì)胞系中，

19、MCP高表達(dá)于U937、K562和HSB2細(xì)胞；而在Molt-4、Daudi、和Raji細(xì)胞表達(dá)較低，因此，我們選擇U937為原材料進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以獲得MCP的cDNA。MCP為跨膜型細(xì)胞膜表面糖蛋白，在SDS-PAGE上表現(xiàn)為非均一的特殊的寬雙帶，具有8種不同的變異型。其編碼基因與其它RCA家族成員一起連鎖定位于第1號(hào)染色體，長(zhǎng)度至少43kb，含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。第1個(gè)外顯子編碼5非翻譯區(qū)和信號(hào)肽，第26個(gè)外顯子編碼4個(gè)SCRs，其中SCR-1、-3、-4由單一外顯子編碼，SCR-2由2個(gè)外顯子編碼。第79外顯子編碼富含絲氨酸/蘇氨酸O-糖基化區(qū)域（S/T區(qū)），第10外顯子

20、編碼功能不明區(qū)，第11、12外顯子編碼跨膜區(qū)和部分胞漿區(qū)。第13和14外顯子可有不同的剪接，第13外顯子存在時(shí)，它編碼長(zhǎng)16aa的胞漿尾（稱(chēng)為CYT1），第14外顯子編碼3非翻譯區(qū)；如第13外顯子存在時(shí)，第14外顯子編碼長(zhǎng)23aa的胞漿尾（稱(chēng)為CYT2）和3非翻譯區(qū)。現(xiàn)已證明，MCP蛋白的變異型是由于在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，CYT段和S/T區(qū)的不同剪接所造成。在S/T區(qū)含有7、8、9三個(gè)大小相同的外顯子，分別稱(chēng)為STA、STB和STC，能產(chǎn)生4種變異型：STABC、STBC、STB和STC。蛋白電泳中STABC變異型者相對(duì)分子質(zhì)量為6700075000；STBC為6200067000；STC為54000

21、56000，這種寬范圍的變化可能與翻譯后的修飾有關(guān)10。本實(shí)驗(yàn)所克隆得到的MCP cDNA長(zhǎng)1144bp，含32bp的5非翻譯區(qū)和一個(gè)編碼369aa的開(kāi)放閱讀框架。其中前102bp編碼34aa的信號(hào)肽，后1005bp包括4個(gè)SCR區(qū)、STC區(qū)、跨膜區(qū)和由CYT2編碼的胞漿尾，共335aa。其變異型為STC+CYT2。MCP作為一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白具有非常重要的功能，它可與C3b或C4b結(jié)合，促進(jìn)I因子對(duì)其進(jìn)行裂解。MCP的這種輔助因子活性比H因子高50倍，能夠有效地控制補(bǔ)體的活化，保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷，因此在移植免疫、腫瘤免疫、生殖免疫等方面受到人們的重視。本研究建立了表達(dá)MCP的小

22、鼠NIH3T3細(xì)胞系，并證明其具有抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑的活化作用，這不僅對(duì)深入探討不同變異型結(jié)構(gòu)的MCP分子與補(bǔ)體抑制功能的關(guān)系有一定的意義，而且為進(jìn)一步研究MCP分子的其它功能及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。作者單位：400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫教研室(白云，姜曼，朱錫華)；河北省石家莊市白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)科(王更銀)參考文獻(xiàn)1Seya T,Turner J,Atkinson JP. Purification and characterization of membrane cofactor protein (gp 45-70) which is a cofactor of C3b

23、 and C4b. J Exp Med， 1986，163?837-855.2Lublin DM，Liszewski MK, Post TW, et al. Molecular cloning and chromosomal location of human membrane cofactor protein(MCP): evidence for inclusion in the multi-gene family of complement regulatory proteins. J Exp Med，1988，168?94-99.3Ballard LL, Bora NS, Yu GH,e

24、t al. Biochemical characterization of membrane cofactor protein of the complement system. J Immunol，1988，141?3923-3929.4，1993，75?295-305.5Naniche D, Lublim DM, Holers VM, et al. Human membrane cofactor protein (MCP) acts as a cellular receptor for measles virus. J Virol，1993，67?6025-6032.6Anderson DJ, Michaelson JS, Johnaon PM, et al. Trophoblast leucocyte-common antigen is expressed by human testicular germ cells and appears on the surface of acrosome-reacted sperm. Biol Peprod， 1988，41?285-293.7Seya T