1、單克隆抗體得制備流程（ 一）動物得選擇與免疫1。動物得選擇純種B ALB /C小鼠，較溫順，離窩得活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈得實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術得實驗室多選用純種BALA/ C小鼠。，獲得高質量得 Me A b，免疫方案應根據抗原2免疫方案選擇合適得免疫方案對于細胞融合雜交得成功至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫 得特性不同而定。（ 1） 可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑 :福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1- 581ml，0、2 m 1/點）周后 第二次免疫劑量同上超過

2、0、 5ml）周后 第三次免疫劑量同一 J2 3 周Oyg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0、，加福氏不完全佐劑皮下或ip （腹腔內注射）（ip劑量不宜，不加佐劑,i p（ 57天后采血測其效價）加強免疫，劑量505 00 ug為宜，ip或iv （靜脈內注射）天后 取脾融合 目前 ，用于可溶性抗原 （特別就是一些弱抗原） 得免疫方案也不斷有所更新，如:將可溶性抗原顆粒化或固相化 ，一方面增強了抗原得免疫原性，另一方面可降低抗原 得使用量。改變抗原注入得途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。使用細胞因子作為佐劑 ，提高機體得免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原得反應性。 （2）顆粒抗原免疫性強

3、，不加佐劑就可獲得很好得免疫效果。以細胞性抗原為例， 免疫時要求抗原量為 12X107 個細胞。初次免疫 1 X107/0、 5ml ipJ 2 3周后第二次免疫 1 XI 0 7/0、5m lip周后加強免疫（融合前三天）1 X1 0 7/0、5 m l ip或iv J取脾融合（二）細胞融合1. 細胞融合前準備（1）骨髓瘤細胞系得選擇 :骨髓瘤細胞應與免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高 ，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量 M C Ab.（2） 飼養細胞 :在組織培養中 ，單個或少數分散得細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞 ，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入得這種細胞數被稱為飼

4、養細胞.在制備M eAb得過程中,許多環節 需要加飼養細胞 ，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化與擴大培養過程中，加入飼養細胞 就是十分必要得。 常用得飼養細胞有 :小鼠腹腔巨噬細胞 （較為常用 ）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞.飼養細胞得量為一般為2X104或10 '細胞/孔。2。細胞融合得步驟(1) 制備飼養細胞層 :一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。與免疫小鼠相同品系得小鼠，常用B A LB/C小鼠，6 1 0周拉頸 處死，浸泡在 75%酒精內，35minJ用無菌剪刀剪開皮膚 ，暴露腹膜J用無菌注射器注入 56m I預冷得培養液(嚴禁刺破腸管)

5、J反復沖洗 ，吸出沖洗液J沖洗液放入10 m 1離心管,12 0 0 rp m/分離56minJ用20%小牛血清(N C S)或胎牛血清(FC S)得培養液混懸，調整細胞數至1X1 05/mIJ力口入96孔板,1 00卩I孔J放入3 7 C CO2孵箱培養(2) 制備免疫脾細胞最后一次加強免疫 3 天后小鼠拉頸處死J無菌取脾臟，培養液洗 一次J脾臟研碎 ，過細胞篩J離心，細胞用培養液洗 2次J計數J取10'脾淋巴細胞懸液備用(3) 制備骨髓瘤細胞取對數生長骨髓瘤細胞離心J用無血清培養液洗2次J計數 ，取得 X1 07細胞備用(4) 融合 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:1 0或1: 5得比例

6、混合在一起，在5 0 ml離心管中用無血清不完全培養液洗 1次，離心,12 0 0 r pm, 8 m i n;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響 聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動. 90 s內加入3 7C預溫得1ml 45%PEG(分子量40 0 0)溶液，邊加邊輕微搖動。37C水浴作用90 S . 加37C預溫得不完全培養液以終止PEG作用，每隔2 mi n分別加入1ml、2ml、3 ml、4 ml、5m l 與 6 m l。 離心,8 OOrpm, 6m i n。 充上清，用含20 %小牛血清HA T選擇培養液重懸。 將上述細胞，加到已有飼養細胞層得 96孔板

7、內，每孔加1001 一般一個免疫脾臟可接 種 4 塊 96 孔板。 將培養板置 37C、5% C O 2培養箱中培養。脾細胞與骨髓瘤細胞經 PEG 處理后 ,形成多種細胞得混 .在 HAT 選擇培養液中培養時 ,由于 ,故不能生長繁殖 ,而雜交瘤細胞具有（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測1 .H A T選擇雜交瘤細胞合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成得雜交瘤細胞才有意義 骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶 上述兩種酶，在HA T選擇培養液可以生長繁殖。,3 4天后瘤細胞消失，雜交細胞形在用 HAT 選擇培養1 2 天內 ,將有大量瘤細胞死亡成小集落，HAT選擇培養液維持710天后應換用H

8、T培養液，再維持2周，改用一般培養液。 在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底 1/10面積時,即可開始檢測特異性抗體，篩選出 所需要得雜交瘤細胞系.在選擇培養期間，一般每23天換一半培養液。,選擇不同得2。抗體得檢測檢測抗體得方法應根據抗原得性質、抗體得類型不同篩選方法 ，一般以快速、簡便、特異、敏感得方法為原則。常用得方法有：（1 ）放射免疫測定（RI A）可用于可溶性抗原、 細胞McAb得檢測。（2） 酶聯免疫吸附試驗（ELI SA）可用于可溶性抗原、細胞與病毒等 M C Ab得檢測.（3）免疫 熒光試驗適合于細胞表面抗原得Me Ab得檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘

9、附雙層吸附試驗等。（四）雜交瘤得克隆化雜交瘤克隆化一般就是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT 篩選后得雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆.在實際工作中 ，可能會有數個甚至更多得克隆 ，可能包括,對于檢測抗體陽性,因為抗體非 二者競爭得結果會使抗體分泌得細胞丟 ,以防止雜交瘤細胞得突變或染色體丟抗體分泌細胞、 抗體非分泌細胞、所需要得抗體（特異性抗體）分泌細胞與其它無關抗體得 分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化.克隆化得原則就是 得雜交克隆盡早進行克隆化 ，否則抗體分泌得細胞會被抗體非分泌得細胞所抑制 分泌細胞得生長速度比抗體分泌得細胞生長速度快， 失。即使克隆化過得雜交瘤細

10、胞也需要定期得再克隆 失，從而喪失產生抗體得能力。克隆化得方法很多，最常用得就是有限稀釋法O， 計數 .1 。有限稀釋法克隆 （ 1）克隆前 1 天制備飼養細胞層（同細胞融合） （2）將要克隆得雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干（3 ）調整細胞為 310個細胞 /ml.（4）取頭天準備得飼養細胞層得細胞培養板，每孔加入稀釋細胞1 00 U.孵育于3 7C、5%C O2孵箱中。（5）在第 7天換液，以后每 23天換液 1次。 （ 6）89 天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7）將陽性孔得細胞移至24孔板中擴大培養。（8 ）每個克隆應盡快凍存。（五）雜交瘤細胞得凍存與復蘇1。雜交瘤細胞得凍存細胞

11、凍存液：50%小牛血清；4 0%不完全培養液；10% DMS O （二甲基亞砜）。凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速.凍存時從室溫可立即降至0C后放入-70 C超低溫冰箱 ,次日轉入液氮中2 .細胞復蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出,放37C水浴中，在1mi n內使凍存得細胞解凍，將細胞用 完全培養液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好得飼養層細胞得培養瓶內，置37 C、5%CO2孵箱中培養 ，當細胞形成集落時 ，檢測抗體活性 .（六）單克隆抗體得大量生產大量生產單克隆抗體得方法主要有兩種 :（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為106 0/ml ,如果大量生產，費用較高。（2）體內接種雜交瘤細胞 ，制備腹水或血清。實體瘤法：對數生長期得雜交瘤細胞按13 X107/ml接種于小鼠