1、    變形鏈球菌表面蛋白PAc結構基因克隆工程數(shù)據(jù)分析        摘要 目的：使變形鏈球菌重要毒力因子PAc蛋白編碼基因pac的遺傳工程背景清晰化，以利于克隆構建DNA防齲疫苗。 方法：運用DNASIS計算機分析軟件包對pac全基因DNA序列進行酶切譜，開放閱讀框，遺傳密碼子，編碼蛋白等結構參數(shù)分析，并就pac基因克隆化方案作出探討。 結果：pac基因中多個限制性內切酶切點可供制取含重要功能域的目的DNA片段以克隆化；重要密碼子及開放閱讀框的闡述可幫助準確制定編碼產生正

2、確PAc讀框的克隆方案。結論：pac基因的遺傳工程背景資料分析增強了其克隆化方案的可操作性。關鍵詞 pac基因；DNA分析軟件包；克隆工程中分類號R781文獻標識碼A文章編號1000-4661(2000)02-0090-04Data analysis of cloning engineering of pac gene, a surface protein encoding gene of Streptococcus mutansPENG Zhi-xiang, FAN Ming-wen, BIAN Zhuan（College of Stomatology, Hubei Medical Univ

3、ersity, Wuhan 430079）Abstract Objective：To clarify the genetic engineering background of pac gene which codes PAc protein, an important virulence factor of Streptococcus mutans, so as to clone pac gene and construct anti-caries DNA vaccine. Methods：A DNA software packages was used to analyze the pri

4、mary structure parameters of pac gene, including restriction sites, open reading frame, codons and amino acid sequence. Cloning programs were then discussed. Results：Several restriction sites in pac gene could be used to produce DNA fragments which contain important regions and then be cloned; Revea

5、ling of key codons and open reading frame might be helpful to the mapping out of pac gene cloning programs. Conclusion The analysis of genetic engineering background of pac gene facilitates an accurate practice of relevant cloning programs.Key Words pac gene；DNA software packages；cloning engineering

6、自齲病被證實為一種細菌感染性疾病以來，人們一直希望通過免疫學方法達到預防齲病的目的。現(xiàn)代分子克隆工程技術為實現(xiàn)這一目的提供了最先進的手段。本文運用DNA計算機分析軟件包對主要致齲菌變形鏈球菌（S.mutans）重要毒力因子PAc蛋白的結構基因pac全序列進行了限制性內切酶識別位點、開放閱讀框、遺傳密碼子、 編碼蛋白等結構參數(shù)分析，并結合有關文獻對pac基因分子克隆的背景資料進行了研究，旨在使pac基因克隆工程的數(shù)據(jù)背景清晰化，以利于克隆構建DNA防齲疫苗方案的準確制訂。材料和方法一、材料1 c血清型S.mutans MT8148菌株表面蛋白抗原PAc 全核苷酸序列（Okahashi等，1989

7、）。2 c血清型S.mutans MT8148菌株表面蛋白抗原PAc 全氨基酸代碼序列 （美國GenBank, 權限號X14490，1995）。二、方法運用DNASIS計算機分析軟件包（日本日立軟件工程公司開發(fā)），對pac基因核苷酸序列及PAc蛋白氨基酸序列進行限制性內切酶識別位點、開放閱讀框、遺傳密碼子、 編碼蛋白、特定氨基酸含量等一級結構參數(shù)分析。結果一、結構區(qū)域分析pac基因的核苷酸序列由4695 個堿基組成，編碼1565個殘基的蛋白質。pac基因產物中有兩個重復氨基酸序列區(qū)域，其中一個在N末端的219464位殘基，富含丙氨酸，但不含脯氨酸及甘氨酸，為A區(qū)。A區(qū)由三個串聯(lián)重復片段組成。另

8、一個保守區(qū)域是在中央?yún)^(qū)的867967位殘基，富含脯氨酸，為P區(qū)。P區(qū)以39個殘基為一個片段單位串聯(lián)重復2.5次。C末端14931544位殘基有一個富含脯氨酸序列。以上分析結果同Okahashi發(fā)表的文獻數(shù)據(jù)1。表1脯氨酸(proline)及丙氨酸(alanine)在A/P/C末端區(qū)和PAc中的含量A區(qū)P區(qū)C末端區(qū)pac全序列proline (%)alanine (%)二、限制性核酸內切酶識別序列在分子克隆過程中，目的基因片段通常由限制性核酸內切酶切割DNA分子獲得，而具有單一酶切識別位點的內切酶最為常用，此類酶可以準確地切下所需DNA片段并使其被最大限度回收。以下為pac基因中具單一酶切識別位

9、點的限制性內切酶： 表2pac基因中具有單一酶切識別位點的限制性核酸內切酶內切酶識別序列切割位點（bp）所切片段大小（bp）BamHG!GATCC44834482, 213BglGCCNNNN!NGGC11301129, 3566HindA!AGCTT3933 3932, 763 SacGAGCT!C12061205, 3490SacCCGC!GG45264525, 170XbaT!CTAGA16631662, 3033通常選擇兩個單一切點限制性內切酶進行雙酶切，以得到目的基因片段。在上述pac基因單一切點內切酶中，有幾組酶因所切片段包含了pac基因中的重要結構區(qū)域而引起注意： 表3pac基因

10、雙酶切所得目的片段及所含重要結構區(qū)域內切酶目的片段大小（bp）所含重要區(qū)域Bgl/ Sac3396部分A區(qū)部分C末端proline豐富區(qū)完整P區(qū)Bgl/ BamH3353部分A區(qū)完整P區(qū)Sac/ Sac3300部分A區(qū)部分C末端proline豐富區(qū)完整P區(qū)Sac/ BamH3277部分A區(qū)完整P區(qū)Xba/ Hind2270完整P區(qū)Xba/ Sac2863部分C末端proline豐富區(qū)完整P區(qū)Bgl與Sac同樣能切下含部分A區(qū)的片段，但使用前者可以得到A區(qū)三個串聯(lián)重復片段中的第三個完整片段（A3片段），而后者只能切下A3片段的一部分，因此如有必要使用這兩個酶中的一個，選擇Bgl似乎更為合適。三、

11、起始/終止密碼構建pac DNA重組體的主要目的是使pac基因得到表達，而目的產物蛋白質的表達是通過對克隆化基因的翻譯得以實現(xiàn)的。在此過程中，起始密碼與終止密碼起著極其重要的作用。為了便于進行pac基因克隆化的工作，在此列出pac全基因中所有三種閱讀框的起始密碼ATG與終止密碼TAA的位點以供參考： 表4pac基因內起始與終止密碼 (ATG & TAA)ATG1116137253305326338344464476530541575584605659734755779809830851905980986001025034107608209711815122623212472712803

12、223284334841529154415681598160116341658169116941708171817791853201820422066211621772182218922422271228523032323234223722377239224232456247725462591266327082780282528973119320932183224327833383341338033833389340434373497351235483623362936833689369537613836384538833901392339563962398640134049405541544

13、15741634384443646194627TAA3036 45147213276309348351363402435456492504519552573594612732777858884903933990102310651086114911791236126913111332135914131418144914791499158116741689173417571764177618301857186918992013205520642091210321212136220522112247231923372375240924532460247524842493251725352564276

14、02985300930303039306330783171322232313276329133363354336033963429344734563459346834773483348635163554357636873693372037293771378938193891395439843993399940054022404740744086419742274262429643144425444245384610討論 S.mutans因與齲病的高度相關性而一直為研究者們所重視。不斷有學者從事相關微生物及免疫學研究，以期找到其可用抗原成分，從而研制出防齲疫苗以從微生物環(huán)節(jié)阻止齲病的發(fā)生。c血清

15、型S.mutans細菌表面蛋白抗原PAc由于參與介導了細菌與牙表面獲得性膜之間的粘附過程被視為S.mutans的重要毒力因子，而且又與哺乳動物心肌無交叉免疫反應，因此被視為構建防齲疫苗的合適抗原之一。在運用基因工程預防齲病方面，樊明文等在國內首先開展了基因重組防齲的研究工作，為齲病預防開辟了一條新的途徑26。為了使齲病的重要相關菌S.mutans的表面蛋白編碼基因pac的遺傳學背景更加清晰，以利于運用分子克隆技術構建pac DNA重組體疫苗，本文通過運用DNASIS計算機軟件包對pac全基因DNA序列進行了酶切譜、開放閱讀框、遺傳密碼子、編碼蛋白等一級結構參數(shù)分析，并參考有關文獻對pac基因分

16、子克隆的背景資料進行了研究分析。1989年Okahashi等完成了pac基因的DNA序列測定。在pac基因內，A區(qū)和P區(qū)的保守性將可能對合成防齲疫苗有重要的意義。1993年Okahashi合成了覆蓋A區(qū)一個重復單位的連續(xù)重疊合成十肽，再用PAc抗血清進行抗原決定簇分析，結果在A區(qū)發(fā)現(xiàn)了多個決定簇7。1994年Matsushita等合成了覆蓋整個PAc 分子的重疊十肽，在覆蓋A區(qū)的十肽中有多個與人抗PAc 血清抗體顯示陽性反應。在覆蓋中間區(qū)的十肽中，有數(shù)個與血清抗體發(fā)生強陽性反應，該二區(qū)域內的抗原決定簇可能與人類抗PAc 蛋白的體液應答相關89。因此，在從pac基因上制取目的基因片段時，最好選擇

17、可切下盡可能完整的A區(qū)和/或P區(qū)的限制性核酸內切酶，從而保證PAc 蛋白的抗原性能得到最大程度的保留。由于PAc 蛋白是由其特定的開放閱讀框決定編碼的，因此在pac基因克隆化工作中選用限制性酶切割制備目的片段時，一定要注意避免產生移框效應而導致編碼另外兩種閱讀框對應的非目的蛋白產物。理想的情況是，限制性酶切割位點下游出現(xiàn)的第一個起始密碼是在編碼PAc 蛋白的開放閱讀框內，但pac基因中所有具單一酶切識別位點的限制性酶在切開pac基因后均產生移框效應，這給pac基因克隆化工作增加了一定的困難，如果僅僅簡單地選擇兩個限制性酶切割制取一段目的基因片段克隆入表達載體，那么所得到的表達產物就不會是PAc

18、 蛋白。因此，在進行pac基因克隆方案設計時，應考慮采取相應的對策以保證開放閱讀框的正確性。當選用適當?shù)南拗菩悦钢频胮ac基因中某個目的片段以后，下一步即將目的片段與載體DNA進行體外重組。由于pac基因內沒有能保持PAc 蛋白的開放閱讀框不變的單一切點限制性酶，因此可以采取以下克隆化方案構建重組體。融合蛋白方案：某些質粒載體在其準備用于轉錄外源DNA的啟動子下游 附近具有起始密碼，因此，在插入外源DNA片段后可表達融合蛋白，此種蛋白的一部分由載體DNA編碼，另一部分由外源DNA編碼，融合蛋白可具有外源基因編碼的天然蛋白的功能及抗原性。只要選擇適當?shù)目寺≥d體及限制性酶，校對閱讀框至準確無誤，就

19、可以將切割好的pac基因片段構建到讀框正確的融合基因中，從而解決因pac基因中缺少不改變PAc 蛋白閱讀框的單一切點限制性酶帶來的難題。PCR方案：聚合酶鏈反應（PCR）擴增目的基因方案最大的優(yōu)點是可完全不受pac基因內單一切點限制性酶的局限，根據(jù)研究目的不同可任意選擇pac基因中一段DNA序列作為模板序列，在設計引物時將準備用作載體的質粒多克隆位點上選定的限制性酶識別序列作為引物的一部分，如此擴增片段的兩個末端即帶上了與質粒相同的限制性酶切點，載體和擴增片段都用同樣的酶消化后即可將后者克隆入載體，完成重組體的構建。通過PCR得到的DNA產物特異性強，使用此方案可使pac基因的克隆化操作變得更

20、為準確和快捷。本課題受國家自然科學基金資助(基金編號39770799)作者簡介彭志翔（1963），男，湖北武漢人，湖北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔內科主治醫(yī)師，博士研究生。邊專（湖北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，湖北武漢430079）彭志翔（湖北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，湖北武漢430079）樊明文（湖北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，湖北武漢430079）參考文獻1Okahashi N, Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c Streptococc

21、us mutans,implicated in dental caries. Mol Microbiol, 1989, 3: 673-6782宋光泰，樊明文. 質粒pBR322介導的變形鏈球菌染色體DNA基因轉化研究. 口腔醫(yī)學縱橫，1994，10（3）：1313凌均啟，樊明文. 基因重組乳鏈球菌防齲疫苗的研究 II. 變形鏈球菌結構基因重組質粒對乳鏈球菌的克隆. 華西口腔醫(yī)學雜志，1994，12（2）：86894杜民權，樊明文，邊專等. 柱層析法純化變形鏈球菌表面蛋白質抗原I/II的研究. 口腔醫(yī)學縱橫，1996，12（3）：1315汪喻忠，樊明文，凌均啟等. 基因重組乳鏈球菌防齲疫苗免疫定菌鼠的實驗研究. 口腔醫(yī)學縱橫，1998，14（2）：716