1、項目名稱：癌細胞微環境中蛋白質因子的功能與調控首席科學家：起止年限：2009.1至2013.8依托部門：科委 教育部一、研究內容總體設想我們將著重于對乳腺癌的研究，應用不同的細胞和動物模型以及人類患者的組織病理標本進行研究，闡明癌細胞微環境中的上述蛋白因子在腫瘤生長和轉移的作用機理，并緊密結合臨床醫學，探尋腫瘤預防和治療的有效途徑和新的藥物靶點。擬解決的關鍵科學問題以多種細胞和動物模型及人類患者的組織標本為研究對象，揭示腫瘤微環境中重要的蛋白因子在腫瘤的發生、發展和轉移等過程中的重要的病理改變的分子基礎、蛋白分子網絡及其信號傳導途徑，在分子水平闡述腫瘤發生和轉移的機制，探尋腫瘤防治的有效途徑和

2、新的藥物靶點。為此，我們提出以下四個研究課題：一、VEGI激活免疫系統并抑制由骨髓來源的內皮前體細胞支持的腫瘤血管生長的機理；二、PINCH-ILK復合體及轉錄因子ATF4在細胞粘附與癌細胞骨轉移、生長及骨破壞的作用機理；三、趨化因子MCP-1及其受體信號傳導途徑為靶向的乳腺癌骨轉移的研究；四、Omega-3多不飽和脂肪酸 (n-3 PUFA) 合成酶FAT-1抑制腫瘤的作用機理。癌細胞微環境里的這些蛋白因子都在一定程度上參與血管生成，細胞黏附和移動，癌細胞骨轉移，和膜蛋白受體信號傳遞。同時，這些蛋白因子在細胞內的作用都在一定形式上經過核因子NFkB的中介。因此，這四個課題密切相關、相輔相成。

3、研究內容一、抑制由炎癥促進和由骨髓干細胞來源的內皮前體細胞支持的腫瘤血管生長我們的研究表明，VEGI有抑制腫瘤新生血管生長和激活免疫細胞的作用，這種作用使VEGI可能成為抗腫瘤的藥物制劑。我們為進一步的研究提出以下兩個假說：1）VEGI通過樹突狀細胞（DC）發揮部分抗腫瘤的作用；2）VEGI可以抑制內皮前體細胞(EPC)支持的腫瘤血管新生。為了對上述假說進行驗證，我們提出了兩個明確的研究方向：1、 研究VEGI是否通過激活DC導致腫瘤生長抑制。我們將探討以下三個問題：1）VEGI是否能夠激活宿主體內DC抗腫瘤細胞毒性以及能否誘導DC分泌Th1型細胞因子。2）VEGI是否能夠誘導DC細胞對腫瘤的

4、浸潤，并刺激DC的成熟以提高它們殺傷腫瘤細胞的活性。3）用DC缺失型的免疫無能裸鼠來研究VEGI抗腫瘤的作用在何種程度上依賴于DC激活的宿主免疫系統。2、研究VEGI對EPC導致的腫瘤血管發育產生何種影響：1）VEGI是否對骨髓造血干細胞（HSC）和內皮前體細胞(EPC)的形成有直接的抑制作用。2) VEGI是否能夠抑制EPC支持的腫瘤血管發育和生長。3）在已被VEGI消除了血管內皮細胞的腫瘤里，EPC能否修復內皮細胞缺損的血管。二、細胞粘附、遷移和凋亡在乳腺癌發生及發展過程中的作用1 闡明細胞粘附和遷移的分子機理。近年來發現的PINCH-ILK-Parvin復合物在調節細胞粘附和遷移上起關鍵

5、作用。然而，在分子水平上這個復合物是怎樣調節細胞粘附和遷移仍然不清楚。我們最近發現這個復合物對特異性粘附以及細胞骨架蛋白有作用。本課題研究的一個重點內容是證明這些相互作用，研究他們是怎樣調節細胞粘附和遷移以及信號傳導途徑。2 證明ILK和相關蛋白在血管形成、腫瘤轉移中的功能。ILK及相關蛋白是細胞粘附和遷移所必需的成分，因此，通過抑制ILK復合物有可能達到抑制血管形成和腫瘤轉移的目的。3 乳腺癌細胞中轉錄因子ATF4在癌細胞增殖過程中的作用。ATF4在細胞增殖中起著非常重要的作用， ATF4基因敲除小鼠的細胞增殖能力顯著下降。調節細胞周期的關鍵因子cyclin A1和 D1 蛋白表達水平也顯著

6、下調。我們將研究ATF4在乳腺癌細胞增殖中的作用。4 乳腺癌細胞中ATF4在癌細胞凋亡中的作用。ATF4已被報導抑制細胞凋亡。 我們最近的預試驗結果發現 ATF4基因敲除小鼠中成骨細胞前凋亡顯著增加。 我們將研究ATF4在乳腺癌細胞在骨組織生存和增殖中的作用。5 成骨細胞中ATF4在乳腺癌誘導血管形成中的作用。骨骼是具有一種相對缺氧的微環境的組織，而乳腺癌細胞在骨骼組織中生長和增殖將進一步加重缺氧 (hypoxia)。 成骨細胞中高量表達ATF4, 缺氧環境刺激成骨細胞表達大量ATF4蛋白質。 而后者是血管形成因子VEGF表達的主要蛋白調節因子。因此 ATF4可能是介導乳腺癌誘導血管形成的關鍵

7、因子。為此，我們將應用已經建立的體內體外模型研究 ATF4在乳腺癌誘導血管形成中的作用。6 破骨細胞中ATF4在乳腺癌骨破壞中的作用。我們最近的預試驗結果發現 ATF4基因敲除小鼠中破骨細胞前體增殖能力顯著下降，而且破骨細胞前體不能分化形成具有骨吸收能力的多核破骨細胞。這些發現表明ATF4調節破骨細胞的增殖和分化。 我們將研究ATF4在乳腺癌骨破壞中的作用。三、趨化因子及其受體信號傳導途徑為靶向的乳腺癌骨轉移的研究我們的假說是，趨化因子和趨化因子受體由腫瘤細胞及骨微環境中的細胞表達和產生，它刺激乳腺癌細胞的增殖和遷移，同時誘導破骨細胞的形成。這些作用導致乳腺癌引起的骨質破壞，增強腫瘤細胞在骨微

8、環境中的生長和增殖。因此，趨化因子和趨化因子受體信號傳導途徑可能在乳腺癌骨轉移中發揮非常重要的作用。1 首先通過MCP-1 knockout鼠與SCID小鼠雜交，產生MCP-1-/-SCID鼠，這種小鼠的骨微環境中MCP-1的產生將缺失。2 我們將觀察骨微環境中MCP-1的丟失是否減少腫瘤細胞在骨骼中的生長及骨質破壞的形成。我們將腫瘤細胞 (MDA-231 or MCF-7)直接注射到基因knockout鼠及正常對照鼠的骨髓腔中(tibial-injection)，然后通過骨計量學、microCT等技術檢測腫瘤的生長及骨質的損傷；3. 觀察骨微環境中MCP-1的喪失是否減少腫瘤骨轉移的發生。我

9、們將腫瘤細胞用熒光素酶或綠色熒光蛋白進行標記、擴增，注射到小鼠體內（心臟注射及皮下注射），應用實時成像技術，活體觀察腫瘤細胞在MCP-1/SCID小鼠體內的轉移及造成骨質損傷的過程。四、Omega-3多不飽和脂肪酸 (n-3 PUFA) 對腫瘤的抑制作用1 n-3 PUFA抑制人類乳腺癌細胞的體外研究。同時研究其可能機制，包括對脂筏中的蛋白信號傳導的影響，對前列腺素E2的抑制。2 建立FAT-1/SCID轉基因鼠模型并進行相關研究。在利用FAT-1轉基因小鼠的實驗當中，戴一凡實驗室及合作者發現FAT-1小鼠對接種的同系小鼠肝癌細胞或大腸癌細胞有顯著的抑制作用。我們計劃將FAT-1基因引進到嚴重

10、聯合免疫缺陷(SCID) 小鼠。利用FAT-1轉基因SCID小鼠作為動物模型來研究n-3PUFA對人類乳腺癌生長和轉移的抑制作用以及探索其機制。構建攜帶FAT-1基因的雙鏈腺相關病毒載體，研究其在乳腺癌基因治療中的作用。二、預期目標總體目標：本研究項目著重于醫學、生物學基礎理論研究，主要針對癌細胞微環境中細胞因子、生長因子及其信號傳遞系統的蛋白質因子動態相互作用對人類重大疾病的影響展開深入研究，以期揭示腫瘤的發病機理，提出診斷或治療的新策略、新靶點和新藥。我們將著重于這些蛋白因子的分子網絡及其信號傳導途徑。本項目期望在有關微環境對癌細胞生長和轉移等關鍵科學問題上取得重大突破性成果，為創建具有國

11、際一流水平的生物醫藥創新和產業化基地奠定基礎和理論依據。并在完成本項目的過程中，培養一批具有國際影響力的高水平和創新能力的人才，形成人類重大疾病研究方面的學術梯隊，為建設我國腫瘤防治研究和高水平人才培養的重要基地做出貢獻。五年預期目標：1闡明VEGI對骨髓造血干細胞來源的血管內皮前體細胞支持的腫瘤血管生長抑制的作用機理。2闡明VEGI在促進樹突狀細胞（DC）成熟和激活免疫系統抗癌功能方面的作用機理。3闡明細胞粘附和遷移的分子機理。在分子水平上揭示PINCH-ILK-Parvin復合物在細胞粘附和遷移上的關鍵調節作用。4證明ILK和相關蛋白在血管形成中的功能。ILK及相關蛋白是細胞粘附和遷移所必

12、需的成分，因此，通過抑制ILK復合物就可達到抑制血管形成的目的。5闡明轉錄調節因子ATF4調控乳腺癌細胞生長和凋亡的機理。6闡明ATF4在乳腺癌骨轉移造成的骨骼破壞中的作用。7闡明下調趨化因子和趨化因子受體信號傳導途徑在控制腫瘤骨轉移中的作用機理。8闡明n-3 PUFA抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用機制。9培養一批在腫瘤防治等領域具有國際競爭力的優秀中青年科技骨干和后備力量，造就一支具有攻堅能力、結構合理、創新能力強的科研隊伍。五年計劃培養博士、博士后30-40名，力爭成為我國腫瘤防治研究和高水平人才培養的重要基地。10研究成果主要以研究論文和獨立開發的技術成果（專利）形式發表，五年內爭取在國際

13、專業學術期刊上發表高水平研究論文40篇，包括在高影響因子的刊物上。11主辦1次腫瘤防治方面的國際性學術研討會。12獲得國家、省部級科技獎勵多項。三、研究方案總體思路腫瘤是嚴重危害人民健康的重大疾病。腫瘤的發育、生長和轉移是一個極為復雜的生物學現象，涉及到許多蛋白質翻譯后修飾和動態相互作用，細胞內、細胞間信號傳遞，以及在分子水平、細胞水平的腫瘤組織微環境、血液和淋巴循環系統、免疫系統整體的調節和控制機理。涉及到的蛋白質包括作為細胞間調控信號的游離的或細胞膜表面的生長因子、細胞因子，細胞表面膜蛋白受體、細胞基質糖蛋白、脂蛋白，以及構成細胞內控制生長、死亡、遷移的信號傳遞途徑。揭示并闡明這些蛋白質的

14、生物學功能，將有助于開發腫瘤預防和治療的新策略、新方法、新技術和新藥品。我們將集中一個團隊的力量，從四個關鍵方向來揭示和闡明腫瘤生長和轉移的蛋白質修飾和動態相互作用。第一，細胞生長抑制因子VEGI及其受體信號系統在腫瘤血管發育和腫瘤生長中的作用機理。第二，細胞粘附因子及其受體信號系統在腫瘤細胞生長和遷移過程中的作用及機理。第三，趨化因子及其受體在癌細胞骨轉移過程中的作用及機理。第四，腫瘤組織中食物來源的不飽和脂肪酸對腫瘤生長的控制作用及機理。這四個互相關聯的研究重點不僅僅表現在共同的目標腫瘤的防治上，也表現在他們涉及的信號系統的重疊與相互作用，以及研究中使用的細胞學、動物學模型的共性和互補性。

15、 技術途徑1）本項目將采取多學科包括生物化學、分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學及蛋白質化學等學科，相互交叉、滲透和有機結合的途徑，重點圍繞蛋白質動態相互作用和信號傳遞途徑在腫瘤生長和轉移中作用機制開展研究。2）使用細胞、組織動物整體及臨床標本，使用純化的重組蛋白因子研究其信號系統。在細胞和動物模型中使用siRNA和納米技術，或基因敲除技術造成信號傳遞的阻斷，并研究其后果。3）建立有關動物模型包括SCID鼠乳腺癌骨轉移模型和-3不飽和脂肪酸轉基因鼠。這些模型一方面是本項目的研究對策，另一方面可以為下一階段確立靶體后的新藥開發研究提供臨床前實驗模型。可行性分析本項目的總體方案是切實可行的。首

16、先，本項目提出的主要科學問題和研究目標不僅具有理論和實際依據，而且都是該領域前沿性和關鍵性的問題。我們在腫瘤的血管形成、腫瘤的粘附、遷移和轉移等領域進行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具備完成本項目的堅實基礎。研究方案建立在申請者以及項目組成員大量的相關研究工作的基礎上，實驗設計合理周密。研究課題所用的方法和材料都是本項目組成員多年應用、被證明是行之有效的方法；而且，我們的課題組成員積累了大量的關鍵性研究材料，如各種腫瘤細胞系，轉基因鼠，RNA干擾技術，蛋白組學技術等，可為本項目的實施提供強有力的保證。我們的這些優勢將保證本項目的順利進行和完成。其次，是人才梯隊方面，承擔本項目研究工作的中

17、堅力量和學術骨干多數都是新近從海外留學歸國的成績卓著的中青年科學家，擁有豐富的研究成果和研究經驗，多次在國際著名專業雜志上發表論文。這些都是確保研究項目順利實施和取得重大成果的最基本、最關鍵的因素。本項目課題組成員熟悉當前的研究狀況和方法，對本項目的研究具有較強的掌控能力和應變能力，能夠保證項目的順利完成。第三，項目承擔單位具有良好的研究條件和基礎，并且已經具備了相當的規模、取得了很好的科研成果，這些已具備的條件和研究優勢將保證本項目的順利實施和圓滿完成。我們擁有完善的蛋白質組學技術平臺，可以完成本項目所涉及的蛋白質組學研究工作。南開大學及其他參與的單位擁有大型及關鍵性儀器設備，采用公共平臺建

18、設方式，已擁有的條件（動物房和儀器設備等）、各重點學科實驗室等設備均可公用，這將為本項目提供較全面的技術條件。本項目注重各研究課題之間的配合、確保信息共享，發揮專業交叉、知識互補、團結協作的精神，確保本項目圓滿、順利完成。創新點本項目探討影響國計民生的的重大科學問題。項目中的四個子課題既相互獨立，又交叉互補。這些課題既是有關研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優勢力量，對腫瘤生長和轉移中的核心問題進行多側面的合作研究。本題目的創新性主要體現在：1）本項目探討的問題是國際前沿的科學問題，因此保證了項目的創新性。本項目的選題涉及癌細胞微環境的結構與功能。癌細胞微環境主要包括：血液循環、淋

19、巴循環、癌細胞表面粘附因子及其信號系統、正常組織細胞、間質細胞和免疫細胞及其信號交流系統、炎癥及其調控信號、性激素及其調控信號、脂肪代謝及其調控信號等等。癌細胞微環境與腫瘤干細胞是當前腫瘤研究領域的核心問題。我們選擇研究癌細胞微環境中一些重要蛋白因子，著重闡明：A.血管內皮細胞抑制因子（VEGI）在抑制腫瘤血管新生中的作用機理。B.癌細胞表面粘附因子在腫瘤生長和轉移中的作用機理。C.趨化因子在癌細胞骨轉移中的作用及機理。D.Omega-3多不飽和脂肪酸抑制腫瘤生長的作用機理。這些課題的研究不僅有助于對腫瘤發育、生長、轉移的生物學機制的理解，也有助于識別新的抗癌藥物的靶標和新的癌癥防治手段。2）

20、本項目的團隊是最近從美國匹茲堡大學醫學院受聘于南開大學的教授團隊。團隊成員均為在美國已經獲得終身或準終身教授職位，得到美國政府科研基金充分資助，有成熟科研項目的高級科學家。這支團隊的成員在美國即已開展合作，已經或正在共同發表文章，因此是一支成熟的科研團隊。本項目采用多學科聯合，綜合運用多種研究手段，集中力量研究癌細胞微環境中蛋白質因子的關鍵信號傳遞系統及相互作用，組建了來自腫瘤生物學、細胞生物學、生物化學、分子生物學和臨床醫學的高級科研人員。3）本項目將基礎科學與臨床科學相結合，力爭在解答基礎科學問題的同時，發展新的癌癥防治的臨床措施。我們預期的臨床科學成果包括下列幾個方面：（1) 作用研究對

21、象的蛋白因子（例如VEGI）和其他試劑（例如特異靶標siRNA）有可能作為抗癌藥物的臨床使用。（2）對有關信號系統的闡明將導致新的抗癌藥物靶體的發現。（3) 研究中建立的新的實驗動物模型，包括血管增生模型，癌的骨轉移模型，轉基因的動物模型，將有可能作為臨床前藥物實驗的模型使用。這些模型多為國際創新，因此具備極大的科學價值和商業價值。課題設置課題一、抑制由炎癥促進、由骨髓干細胞來源的內皮前體細胞支持的腫瘤血管生長研究目標：本課題的主要研究目標是了解血管內皮細胞抑制因子(VEGI)的作用機理，進而把VEGI開發成為用于腫瘤治療的藥物。我們的研究表明，VEGI有抑制腫瘤新生血管生長和激活免疫細胞的作

22、用，為了進一步的研究我們提出以下兩個假說：1）VEGI通過樹突狀細胞（DC）激活宿主免疫系統發揮部分抗腫瘤的作用；2）VEGI抑制內皮前體細胞(EPC)支持的腫瘤血管發育和生長。研究內容：為了驗證上述假說，我們將從兩個方面展開實驗：1）研究VEGI對樹突狀細胞DC的作用。我們的前期實驗表明，VEGI可以抑制移植于T細胞缺陷裸鼠的人乳腺癌或前列腺癌的腫瘤生長。VEGI并且能夠刺激DC的成熟。成熟的DC分泌的細胞因子IL-15, IL-12p70和TNFa能活化T細胞，激發抗腫瘤的非特異性免疫機制，還可以誘導和強化抗腫瘤的特異性免疫機制，例如Th1 T細胞的專一性抗腫瘤反應，能在一定程度上有效地抑

23、制腫瘤生長。在以上研究的基礎上，我們將探索非特異性抗腫瘤機制以及Th1型細胞因子分泌過程中VEGI的作用，還將研究VEGI激發的天然（非特異性）免疫機制控制腫瘤生長的作用。2）研究VEGI對內皮前體細胞EPC的作用。腫瘤新血管形成的過程包括兩個部分血管發育（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）。血管發育是指早期原始血管的生成，血管生成是指在已有血管的基礎上形成新的血管。我們的前期實驗表明，VEGI能有效抑制在血管生成過程中內皮細胞的增殖。然而，如果腫瘤血管發育沒有得到控制，腫瘤新血管的形成也就不能被完全抑制。越來越多的實驗證據表明，來源于骨髓的內皮前體細胞（EP

24、C）對腫瘤血管發育有重要作用。我們的預實驗表明，VEGI參與對骨髓造血干細胞（HSC）功能的調節，阻止HSC到EPC的轉化。我們認為，VEGI有能力抑制腫瘤誘導的HSC和EPC的生成。我們將要研究 1）VEGI是否可以直接作用于骨髓HSC和EPC；如果是這樣，受體和信號傳遞途徑是什么。2）VEGI是否可以阻止EPC參與腫瘤血管發育的過程；3）腫瘤內皮細胞被抗血管生成的藥物消滅后，VEGI能否抑制EPC支持的腫瘤血管再發育。本研究成果可獲得自主知識產權。我們擬培養4-6名博士，發表SCI收錄的期刊論文10-15篇，其中影響因子大于5.0的文章5篇以上。并參加每年的重要國際學術會議進行學術交流。課

25、題負責人：李魯遠 （南開大學）經費分配比例：25%。課題二、細胞粘附、遷移和凋亡在乳腺癌發生及發展過程中的作用研究目標：本課題建立在我們關于細胞粘附、遷移和凋亡的分子機理的研究中取得了一系列在世界上具有開創性意義的成果的基礎上。課題的主要目標是進一步闡明細胞粘附和遷移的分子機理，說明我們近年來發現的PINCH-ILK-Parvin復合物在調節細胞粘附和遷移上起關鍵作用及其信號傳導途徑。研究內容：ILK及相關蛋白是細胞粘附和遷移所必需的成分，本研究可為ILK和相關蛋白在血管形成和腫瘤轉移中的功能提供有力的證據。為開發研究以ILK和相關蛋白為靶點的血管形成的抑制劑和腫瘤轉移抑制劑提供理論和實驗依據

26、。本研究的另一個目標是通過ATF4基因敲除小鼠，研究轉錄因子ATF4在腫瘤生長和轉移過程中的重要作用，ATF4在調節成骨細胞生長和增殖以及保護成骨細胞不進行凋亡中也起著至關重要的作用。我們的最近試驗結果證明，ATF4也調節破骨細胞的形成和成熟。本研究成果可獲得自主知識產權，同時培養4-6名博士，發表SCI收錄的期刊論文10-15篇，其中影響因子大于5.0的文章5篇以上。并參加每年的重要國際學術會議進行學術交流。課題負責人：肖國芝（南開大學）經費分配比例：25。課題三、趨化因子及其受體信號傳導途徑為靶向的乳腺癌骨轉移的研究研究目標：本課題的研究目標是證明MCP-1/CCR2在乳腺癌生長、轉移及骨

27、質損傷中發揮重要作用，通過封閉MCP-1與腫瘤細胞表面的CCR2之間的相互作用，達到降低乳腺癌骨轉移的發生率和減少腫瘤細胞引起的骨質破壞。研究內容：本課題將是國際上首次通過下調MCP-1/CCR2信號傳導途徑，控制腫瘤骨轉移的研究。該研究為腫瘤骨轉移的機制提供一種新的分子模型，為MCP-1/CCR2信號傳導途徑作為靶向治療方法在乳腺癌骨轉移中的臨床應用奠定基礎并提供最重要的實驗依據。本研究是國內首次應用動物腫瘤骨轉移的模型，將填補我國腫瘤骨轉移模型上的空白。成果應用后可指導乳腺癌骨轉移的診斷及骨損傷的預防與治療。該研究有望很快進入臨床期研究。本研究成果可獲得自主知識產權，同時培養4-6名博士，

28、發表SCI收錄的期刊論文10-15篇，其中影響因子大于5.0的文章5篇以上。并參加每年的重要國際學術會議進行學術交流。課題負責人：張健（南開大學）經費分配比例：25。課題四、Omega-3多不飽和脂肪酸 (n-3 PUFA) 對腫瘤的抑制作用研究目標：本課題的主要目標是了解癌細胞微環境中的Omega-3多不飽和脂肪酸 (n-3 PUFA) 對癌細胞生長的抑制作用。研究內容：在應用FAT-1轉基因小鼠的實驗當中，戴一凡實驗室及合作者發現FAT-1小鼠對接種的同系小鼠肝癌細胞或大腸癌細胞有顯著的抑制作用。我們計劃將FAT-1基因引進到嚴重聯合免疫缺陷(SCID) 小鼠。利用FAT-1轉基因SCID

29、小鼠作為動物模型來研究n-3PUFA對人類乳腺癌生長和轉移的抑制作用以及探索其機制。這一動物模型將提供給李魯遠，張健實驗室進行乳腺癌的研究。本研究成果可獲得自主知識產權，同時培養4-6名博士，發表SCI收錄的期刊論文10-15篇，其中影響因子大于5.0的文章5篇以上。并參加每年的重要國際學術會議進行學術交流。課題負責人：戴一凡（南開大學）經費分配比例：25。課題間的相互關系本項目以南開大學為主體，聯合中國醫科院血液研究所及天津醫科大學等單位，圍繞總體研究目標，本項目設立4個課題組，研究過程中相互配合、優勢互補，提倡資源共享，每個課題經費比例各為25。本項目的執行采用首席科學家負責制。首席科學家

30、將充分發揮課題負責人和學術帶頭人的作用，采用學科交叉、分工合作的方式來實施研究計劃。同時，首席科學家將在相關部門的領導下，根據國家規定，通過項目專家委員會，采用激勵和滾動機制對項目進行管理。本項目期望在有關微環境對癌細胞生長和轉移等關鍵科學問題上取得重大突破性成果，保證按期完成項目的總體目標和五年目標。 四、年度計劃研究內容預期目標第一年1）研究VEGI是否對骨髓造血干細胞（HSC）和內皮前體細胞(EPC)的形成有直接的抑制作用。2）建立體內和體外測量血管形成的實驗模型。3）利用成骨細胞特異表達ATF4的轉基因小鼠(OCN-ATF4-tg), 比較乳腺癌細胞在正常和OCN-ATF4-tg小鼠中

31、誘導血管形成的能力。4）比較乳腺癌細胞在正常和ATF4基因敲除小鼠中誘導血管形成的能力。5）利用體外血管形成模型,研究成骨細胞中ATF4水平對乳腺癌細胞誘導血管形成能力的影響。6）檢測乳腺癌細胞及組織是否表達MCP-1及其受體CCR2，以及PTHrP、雌激 素等對MCP-1和CCR2表達的調節作用。7）檢測MCP-1及CCR2在正常乳腺上皮細胞中的表達，應用免疫組化技術檢測含有正常的乳腺組織、乳腺增生組織、原位乳腺癌、乳腺癌轉移組織特別是骨轉移的組織芯片中CCR2的表達。8）觀察IL-6、TNF、PTHrP是否能夠誘導MCP-1和CCR2的表達，研究當MCP-1與破骨細胞、成骨細胞或乳腺癌細胞

32、表面的CCR2結合后的信號傳導途徑。9）選擇乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D、及EMT6，分別用 EPA or DHA作用，同時用AA (-6)作為對照，觀察細胞的生長和凋亡。10）收集上述細胞的裂解液，通過免疫印記實驗（Western blot），檢測EGFR和p38MAPK的磷酸化和Src激酶的表達。11）分離脂筏，Flotillin和糖基化磷脂酰肌醇結合（anchored）蛋白將備用為脂筏的檢測標記。同時用免疫印記技術檢測磷酸化及非磷酸化的EGFR和p38MAPK的表達12）細胞凋亡特異性標志物的檢測。13）其他與-3 PUFA相關的蛋白因子如 cox2、PGE2和

33、-catenin等的檢測。1）闡明VEGI參與控制EPC分化的分子機理。預期實驗結果：認證受體蛋白質分子和信號傳遞途徑中的主要蛋白質分子。2）建立成骨細胞中ATF4在乳腺癌細胞誘導血管形成中的可能作用及其分子機制。3）完成研究內容中提到的MCP-1及其相應受體CCR2在正常的乳腺上皮細胞、不同惡性度的乳腺癌細胞、正常的乳腺組織、增生組織、乳腺腫瘤以及轉移部位組織中的表達、調節及作用機制。4）證明：a) EPA和DHA將能夠明顯的抑制乳腺癌細胞的生長，而AA沒有作用；b) EPA和DHA將能夠改變脂筏的脂質結構， 從而引起乳腺癌細胞凋亡；c) EPA和DHA 將能夠改變乳腺癌細胞中cox2、PG

34、E2和-catenin 的表達。第二年1）研究VEGI是否能夠抑制EPC支持的腫瘤血管發育和生長。2）建立破骨細胞特異表達ATF4 (Trap-ATF4-tg)的轉基因小鼠，測定轉基因小鼠中破骨細胞活性水平。3）比較乳腺癌細胞在正常和 Trap-ATF4-tg小鼠中破骨的能力。4）確立ATF4激活破骨細胞活性的信號傳導途徑。 包括測定ATF4對NF-kB信號傳導關鍵因子如NF-kB p50, p52, 和 p65，NFATc1, c-Fos, RANK, TRAF6, IKKs,p62, p38MAPK, 和 cathepsin K的總蛋白水平或和磷酸化水平以及對TNF-alpha, IL-6

35、, RANKL及MCP-1蛋白產生的影響。5）觀察MCP-1是否改變乳腺癌細胞與骨髓內皮細胞或基質細胞之間的粘附作用，應用CCR2特異性拮抗劑通過體外實驗鑒定其在乳腺癌細胞的遷移、浸潤以及乳腺癌誘導的破骨細胞形成中的作用。6）應用小分子干擾RNA技術（ShRNA），阻斷或減少腫瘤細胞中MCP-1或CCR2的表達，觀察MCP-1或CCR2 的ShRNA穩定轉染的腫瘤細胞在細胞增殖、遷移、浸潤、及誘導破骨細胞形成等功能上的改變。7) Fat-1 基因抑制人類乳腺癌細胞生長的體外研究: 將Fat-1 基因轉入乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D，同時用neo 基因作為對照，觀察細胞

36、的生長和凋亡。8）FAT-1/SCID轉基因鼠的產生：FAT-1基因編碼-3去飽和酶，該酶的功能是將-6脂肪酸轉變成-3脂肪酸。我們已經得到C57/BL6遺傳背景下的FAT-1轉基因鼠，為了得到FAT-1/SCID轉基因鼠，我們將用FAT-1鼠與SCID鼠進行雜交，通過PCR技術和脂肪酸分析鑒定FAT-1/SCID F1代雜交鼠，然后于SCID鼠回交產生FAT-1/SCID轉基因鼠。其子代將應用免疫擴散技術分析血漿中的IgG含量。1）闡明VEGI在活體內對EPC的作用。預期的實驗結果：在VEGI的作用下，構成腫瘤血管壁的EPC的數量明顯下降。 2）建立ATF4在破骨細胞生成和成熟中的作用以及在

37、乳腺癌細胞骨破壞中的作用及其信號傳導機制。3）應用小分子干擾RNA技術，通過體內、體外實驗證實MCP-1、CCR2在乳腺癌生長、轉移以及引起的骨質破壞中的重要作用；證實CCR2在腫瘤細胞中表達的下調，對腫瘤細胞的生長、浸潤具有明顯的抑制作用。4) Fat-1 基因將能夠明顯的抑制乳腺癌細胞的生長并促進凋亡，而neo基因沒有作用。5）產生FAT-1/SCID轉基因鼠,此鼠可作用有效的工具，進行多種人類重大疾病的防治研究。6）累計發表8篇以上研究論文。第三年1）研究在已被VEGI或其它抗血管生長藥物（例如Avastin）消除了血管內皮細胞的腫瘤里，EPC能否修復內皮細胞缺損的血管。2）研究VEGI

38、是否能夠激活宿主體內DC抗腫瘤細胞毒性以及能否誘導DC分泌Th1型細胞因子。3）比較具有不同生長能力的乳腺癌細胞株中ATF4的蛋白表達水平和細胞凋亡之間的關系。4）建立穩定表達ATF4shRNA的乳腺癌細胞株，研究這些細胞株及其對照細胞株在體外和骨組織中的增殖能力和細胞凋亡水平。5）研究ATF4在細胞凋亡信號傳導中的作用， 包括測定ATF4對凋亡信號傳導關鍵因子如各種caspases （1，2， 4， 7，8， 和 9）, Bcl-2, Bax, BAD, Bak, 和 Bok的總蛋白水平，磷酸化水平，生物學活性的影響。6）通過MCP-1 KO鼠與SCID小鼠雜交，產生MCP-1-/-/SCI

39、D鼠，F1代小鼠MCP-1和SCID基因均為雜和型，F1代鼠與SCID鼠回交，將產生SCID遺傳背景的MCP-1雜和型F2代小鼠，F2代鼠之間雜交，將產生25% MCP-1 KO/SCID鼠（此鼠為實驗組），25%正常對照鼠（MCP-1/SCID）。實驗組小鼠骨微環境中MCP-1的產生將缺失，同時該種小鼠的遺傳背景為SCID，因此可作為多種人類重大疾病研究的有效的動物模型。7) 將轉有Fat-1 基因的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D通過皮下注射方式注射到SCID小鼠體內，轉有neo 基因的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D作為對照。 每天觀察腫瘤塊的

40、生長狀況。腫瘤接種2-3周后，將腫瘤塊分離，進行免疫組織化學分析。8）將人類乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、T47D和EMT6通過皮下注射方式注射到FAT-1/SCID及正常SCID小鼠體內，正常SCID小鼠作為對照。每天觀察腫瘤塊的生長狀況。腫瘤接種2-3周后，將腫瘤塊分離，進行免疫組織化學分析和脂筏蛋白分析。1）了解VEGI對于EPC對腫瘤內血管的修復作用的影響。預期的實驗結果：當VEGI在體內達到一定濃度時，EPC不再能參與修復被破壞的腫瘤血管。2）了解VEGI激活DC的作用機理。預期的實驗結果：被VEGI激活的DC顯著增加分泌殺傷癌細胞的蛋白因子，并能顯著提高T細胞對癌細胞

41、的殺傷能力。3）完成研究ATF4在乳腺癌細胞增殖和凋亡中的作用,并探索其信號傳導機制。4）產生MCP-1 KO/SCID鼠,此鼠可作用有效的工具，進行多種人類重大疾病的防治研究。5)轉有Fat-1 基因的乳腺癌細胞在SCID小鼠體內的生長明顯慢于轉有neo 基因的乳腺癌細胞。6)2 乳腺癌在FAT-1/SCID轉基因鼠體內的生長明顯小于正常SCID對照鼠。7）累計發表12篇以上研究論文。第四年1）研究VEGI是否能夠誘導DC細胞對腫瘤的浸潤，并刺激DC的成熟以提高它們殺傷腫瘤細胞的活性。2）建立穩定表達PINCH-ILK-Parvin復合物中關鍵因子shRNA的乳腺癌細胞株，研究這些細胞株及其對照細胞株在體外的粘附和遷移能力。3）利用基因敲除等技術, 研究PINCH-ILK-Parvin復合物中關鍵因子對乳腺癌細胞粘附和遷移的影響