1、    靜止期潰瘍性結腸炎腸粘膜過量 一氧化氮的產生及其意義        摘要應用NADPH-黃遞酶組織化學染色方法和巨噬細胞免疫組織化學ABC法，對17例靜止期潰瘍性結腸炎(UC)患者腸粘膜進行一氧化氮合成酶(NOS)活性測定。結果顯示：靜止期UC患者腸粘膜NOS陽性顆粒數(17.63±0.31個/高倍視野)及巨噬細胞數(35.85±1.02個/高倍視野)均顯著高于健康對照組(分別為P0.05和P0.001)表明：靜止期UC患者腸粘膜中的NO

2、S活性增高，NO產生量增加，巨噬細胞可能是產生過量NO的主要來源，NO的過量存在有可能是UC復發的原因之一。關鍵詞潰瘍性結腸炎，靜止期一氧化氮免疫組化SIGNIFICANCE OF EXCESSIVE GENERATION OF NITRIC OXIDE FROM COLONIC MUCOSA WITH QUIESCENT ULCERATIVE COLITISChen Ji,L Yumin, Ye Simao The Third Hospital, Beijing Medical University，Beijing100083AbstractEndoscopic specimens from

3、 colonic mucosa were tested for nitric oxide synthase(NOS) activity by using nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-diaphorase histochemistry, pathology and macrophage immunochemistry, 17 patients with quiescent ulcerative colitis (UC) and 15 healthy controls being involved.Results show

4、ed that the number of NOS positive particle (17.63±0.31/HP) and of macrophage count (38.85±1.02/HP) in colonic mucosa with quiescent UC inereased statistically than those in controls (P0.05 and P0.001 respectively).It was suggested that high NOS activity and excessive production of nitric

5、oxide existed in the mucosa,the latter may be derived from macrophages and one of the causative factors of UC relapse.Key wordsQuiescent ulcerative colitisNitric oxide Immunohistochemistry潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是非特異性、慢性大腸炎癥性疾病，具有遷延性和復發性的特點，而且其遷延或復發的原因較為復雜，至今并未十分清楚。為此，本研究通過應用NADPH-黃遞酶組織化學方法及巨噬

6、細胞(CD68)免疫組化方法，對17例靜止期UC患者腸粘膜進行一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)活性測定，以反映一氧化氮(nitric oxide, NO)的釋放量，從而探討過量NO的產生與UC復發的關系。資料與方法一、病例選擇：選擇經我院確診為靜止期UC的患者17例，男13例，女4例，年齡1771歲，平均年齡為45.6歲。全部病例均符合1993年全國慢性非感染性腸道疾病學術研討會制定的UC診斷標準及Jones等1診斷靜止期UC的標準；健康對照組15例，選擇因功能性消化不良，腺瘤切除術后復查大腸鏡無異常者。二、標本處理：大腸鏡檢查中，對靜止期UC和相對正常的

7、腸段分別在原病變相對應部位及距肛門10cm正常腸粘膜處鉗取12塊腸粘膜，冰浴上錫紙包封，液氮驟冷備用，同時另取一塊腸粘膜做病理組織學檢查及免疫組化測定，以10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片。三、方法：(一)NDAPH-黃遞酶組織化學染色：參照Dhatt等2方法，標本從液氮中取出-20恒冷切片機連續切片，片厚10m，風扇吹干，丙酮固定(4)10分鐘，每張切片滴加100l組織反應液(包括0.1mM -NADPH，2mM NBT及0.3%Triton X-100)，置濕盒中37孵育45分鐘以0.1M PS液洗滌3次，2%甲基綠復染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下讀片，腸粘膜固有層

8、內出現藍色的顆粒，為NOS陽性顆粒。-NADPH為Sigma公司產品，其余均為A、R級。(二)巨噬細胞免疫組織化學方法：采用免疫組化的ABC法。6m厚切片經脫蠟、脫水和10%正常兔血清封閉后，與1：200鼠抗人巨噬細胞抗體(單克隆抗體，抗)4濕盒孵育過夜，再與1：200生物素羊抗鼠IgG抗體(抗)孵育60分鐘，1：400的辣根過氧化物標親合素(抗)孵育30分鐘，在經H2O2活化的0.02%二氨基聯苯胺(DA-B)染色和蘇木素復染核后鏡檢，CD68陽性細胞為橢圓形或不規則形，呈黃褐色。以上三種抗體均為中山生物技術有限公司產品。(進口分裝)。(三)計量方法：顯微鏡下連續讀片，對HE染色、NADPH

9、-黃遞酶組化染色及巨噬細胞免疫組化反應切片，分別連續計數腸粘膜固有層內不相重疊的十個高倍視野下，單位面積內中性粒細胞、NA DPH-黃遞酶陽性染色顆粒及巨噬細胞陽性顯色細胞數，取其平均值。結果一、病理組織學改變：HE染色可見，靜止期UC患者腸粘膜腺體排列輕度不整，粘液分泌稍差，有的可見輕度纖維組織增生，固有層內有較多的淋巴細胞和漿細胞，偶見中性粒細胞；健康對照組腸粘膜表面上皮完整，腺體排列整齊，含豐富的杯狀細胞，粘液分泌正常，固有層有少量的淋巴細胞。兩組中性粒細胞數的比較見表1。表1靜止期潰結及正常腸粘膜中性粒細胞數比較(HE，個/HP)組別例數±SD靜止期潰結170.21±

10、;0.07正常腸粘膜150.12±0.08注：兩組比較P0.05 二、NOS陽性顆粒計數：靜止期UC腸粘膜固有層內可見散在沿腺窩分布的NOS陽性顆粒，無片狀聚集。正常腸粘膜僅偶見散在的NOS陽性顆粒，分布同前，二者NOS陽性顆粒數的比較見表2。表2靜止期潰結及正常腸粘膜NOS陽性顆粒數比較( 個/HP)組別例數±SD靜止期潰結1717.63±0.31?正常腸粘膜155.31±0.20注：與正常腸粘膜相比較P0.05 三、巨噬細胞分布及計數：靜止期UC腸粘膜CD68陽性細胞沿腺窩分布，與NOS陽性顆粒分布規律相似，無聚集現象；正常腸粘膜固有層內可見散在、少

11、量的CD68陽性細胞，其量明顯少于前者(表3)。表3靜止期潰結及正常腸粘膜CD68陽性細胞數比較(個/HP)組別例數±SD靜止期潰結1735.85±1.02?正常腸粘膜155.37±0.54注：與正常腸粘膜相比較，P0.001 討論九十年代以后，NO與UC的關系，特別是與UC復發的關系較為引人注目。UC多呈反復發作，17例靜止期UC中有41.2%(7/17)復發，復發最多達3次。NADPH-黃遞酶組織化學結果顯示，靜止期UC患者腸粘膜NOS陽性顆粒數顯著高于健康對照組(P0.05)，表明靜止期UC患者腸粘膜NOS活性高于正常腸粘膜，此結果目前國內外尚未見報道。HE

12、切片顯示，靜止期UC和健康對照組中性粒細胞極少或偶見，二者無明顯區別(P0.05)，但從靜止期UC腸粘膜NOS陽性顆粒數高于正常腸粘膜的結果分析，在靜止期UC患者的腸粘膜中應含有NOS，產生高水平NO的其它細胞的存在。巨噬細胞免疫組織化學結果顯示，靜止期UC腸粘膜巨噬細胞數非常顯著高于健康對照組(P0.001)，但兩者中性粒細胞數無差別，提示巨噬細胞可能是靜止期UC腸粘膜產生NO的主要來源。靜止期UC患者腸粘膜巨噬細胞在組織中可存在數周或數月，若在此期間，腸粘膜受內毒素或細胞因子等誘發，則巨噬細胞可表達誘生酶(iNOS)-mRNA，釋放大量NO3，增加的NO又可影響多種免疫活性物質的合成、分泌

13、；如IL-1、IL-2、IFN-及TNF等，它們多數起局部作用，部分以多效激素的方式起全身作用，在UC中能夠激發和放大免疫/炎癥反應，加重炎癥和組織損傷。有報道巨噬細胞在細胞內、外環境變化時可通過NO產生免疫保護，免疫損傷及免疫調節作用4，5。NO除參與調節免疫功能外，將會產生細胞毒作用，在殺傷微生物和腫瘤細胞同時，對周圍正常組織細胞亦有損傷作用，如生成過氧化亞硝酸鹽(OONO?)致膜的脂質過氧化、DNA復制的抑制和細胞能量代謝的障礙6，7等，從而引起炎癥復發或持續存在。急性炎癥之后，腸粘膜層內又會出現新的巨噬細胞，如此反復將導致NO的反復產生，形成惡性循環，由此可能會引起UC的反復復發，因此

14、，本研究的結果提示，靜止期UC腸粘膜NO的產生雖較活動期UC低，但仍較正常粘膜明顯增高，可能是UC復發的原因之一。參考文獻1Jones SC, Crabtree JE, Rembacken BJ, et al. Mucosal interleukin-6 secretion in ulcerativecolitis: effects of auti-inflammatory drugs and T-cell stimulation. Scand J Gastroenterol, 1994,29:722-728.2Dhatt N, Buchan AMJ. Colocalization of ne

15、uropeptide with calbindin D28K and NADPH-diaphorase in the enteric nerve plexuses of normal human ileum. Gastroenterology, 1994,107:680-690.3劉彥.巨噬細胞的激活與其信息傳遞.國外醫學免疫學分冊，1996，4：214.4羅高興.一氧化氮的免疫調節作用.上海免疫學雜志，1996，16：245-247.5鄭永晨.一氧化氮與巨噬細胞的免疫調節.國外醫學免疫學分冊，1995，4：204-206.6Beckman JS, Crow JP, Pathological implications of nitric oxide, superoxide and peroxynitrite formation. Biochem